Hedgehog参与西伯利亚鲟侧线机械和电感受器分化的初始证据

唐智娇范纯新王 健宋佳坤

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 上海海洋大学海洋生物系统与神经科学研究所, 上海 201306; 3. 上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306)

Hedgehog参与西伯利亚鲟侧线机械和电感受器分化的初始证据

唐智娇1,2,3范纯新1,2,3王 健1,3宋佳坤1,2,3

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 上海海洋大学海洋生物系统与神经科学研究所, 上海 201306; 3. 上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306)

为揭示Hedgehog (Hh)信号与神经丘和壶腹器官分化的关系, 研究以西伯利亚鲟(Acipenser baerii Brandt)为模型, 首先对再生过程中的神经丘和壶腹器官的转录组进行比较分析, 发现Hh信号通路关键基因(Shh、Patched 1)在两类感受器中差异表达, 且它们的表达在再生过程中呈现动态性。然后用环巴胺(Cyclopamine, Hh信号抑制剂)处理西伯利亚鲟胚胎(st29), 用扫描电镜和FM1-43荧光染色对西伯利亚鲟仔鱼(st43-st44)分析发现环巴胺显著抑制了壶腹器官的发育。整体原位杂交表明, Shh、Patched1、Smoothened、Gli2在腹面侧线区域的表达受到了环巴胺的抑制。以上结果暗示Hh信号通路与神经丘和壶腹器官的发育有关, 推测Hh信号在神经丘和壶腹器官的分化过程中起到了重要作用。

西伯利亚鲟; 神经丘; 壶腹器官; Hedgehog信号; 环巴胺

包括鱼类和两栖类在内的低等水生脊椎动物具有侧线这一重要的感觉器官。在系统演化过程中, 尽管真骨鱼的电感受器发生了丢失, 但软骨鱼和非新鳍亚纲的侧线系统都是由感受机械振动的机械感受器(神经丘)和感受弱电场的电感受器(壶腹器官)组成[1,2]。这两类功能迥异的侧线感受器都由感觉细胞、支持细胞和神经细胞组成, 且它们都起源于一系列的侧线基板[3]。头部侧线基板通过延伸形成感觉嵴, 然后在感觉嵴的中央区形成神经丘原基, 旁侧区形成壶腹器官原基[1]。目前, 两类侧线感受器分化的分子基础尚不清楚, 而这是理解电感受器在系统进化中出现-消失-再出现的关键。

Hedgehog基因最先在果蝇(Drosophila melanogaster)突变体筛选中发现, 其编码的蛋白是一类重要的形态生成素, 控制果蝇胚胎的分节模式。脊椎动物中存在3个Hedgehog的同源基因: Shh、Ihh和Dhh, 分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。Hh信号转导关键分子还包括识别Hh信号的受体膜蛋白Patched (Ptc)和调控膜蛋白Smoothened (Smo), 以及可进入细胞核的转录因子Gli蛋白。当Ptc和Hh结合以后,解除对Smo的抑制作用, 促使Gli蛋白结合PKA及CK1等因子与微管形成大分子复合物, 使得完整Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录[4—6]。在脊椎动物发育过程中, Hh信号通路调控许多器官和组织的模式形成, 例如眼睛、中枢神经系统、肺、肠和四肢等[7]。

Sapède和Pujades[8]通过Hh信号抑制剂环巴胺处理斑马鱼(Danio rerio)胚胎, 证明了Hh通路对椭圆囊后侧听斑(Macula of utricle)毛细胞的产生和特定神经支配的形成至关重要。Koebernick等[9]用环巴胺处理非洲爪蟾(Xenopus)胚胎, 发现Hh信号调控非洲爪蟾内耳发育。有趣的是, 侧线系统和内耳均起源于头部神经基板[10,11], Koebernick等[9]又进一步证明了Smo的高表达也阻碍了侧线基板发育,说明Hh信号通路参与听-侧线系统的分化。侧线系统中的机械感受器和电感受器都来自侧线基板, 两者的分化是否也受到Hh信号调控？本文以西伯利亚鲟(Acipenser baerii Brandt)胚胎为实验材料, 经转录组分析神经丘和壶腹器官再生过程中Hh信号的表达, 通过扫描电镜和FM1-43荧光染色观察环巴胺对西伯利亚鲟仔鱼侧线系统的影响, 并结合整体原位杂交技术, 初步探讨Hh信号在西伯利亚鲟侧线系统机械和电感受器发育中的作用。

1 材料与方法

1.1 西伯利亚鲟胚胎和仔鱼

西伯利亚鲟受精卵购自大连永新鲟鱼开发有限公司, 在实验室条件下, 养在盛有灭菌胚胎水(63 mg/L CaSO4、10 mg/L MgSO4、4 mg/L KCl、1.1 mg/L NaH2PO4、0.01 mg/L亚甲基蓝)的烧杯中, 每500 mL胚胎水1000颗受精卵, 维持水温18℃左右, 气泵供氧[12]。

1.2 转录组测序

st44期西伯利亚鲟经200 μmol/L新霉素处理2h,胚胎水漂洗3次, 每次5min, 之后于胚胎水中培养。分别于处理后0、12h和24h取神经丘、壶腹器官和表皮于Trizol中保存。每次取样前用0.1% DASPEI荧光染色2min, 胚胎水漂洗3次, 0.05%MS-222麻醉,然后用Stemi-2000立体显微镜在荧光下取样。Trizol法提RNA, 分析RNA的浓度、完整度、质量后用Hiseq-1500测序仪进行转录组测序。

1.3 环巴胺处理胚胎

致畸剂环巴胺对Hh信号的抑制非常特异, 直接抑制Smo信号活性[13]。将西伯利亚鲟胚胎从st29期(此时基板开始形成)开始经20 μmol/L环巴胺(Merck millipore, 用DMSO溶解)处理到st37期, 即出膜后1d (环巴胺共处理4d)。用胚胎水清洗2遍, 之后继续用胚胎水培养。每300 mL胚胎水500颗受精卵,维持水温18℃左右, 气泵供氧。同时, 以等量DMSO处理的胚胎作为对照组, 取样的时间点根据对照组的发育阶段进行确定。部分样品用新鲜的4%多聚甲醛(4%PFA, 4 g多聚甲醛固体溶于100 mL PBS中) 4℃固定过夜后, 经甲醇脱水, 保存于-80℃, 用于整体原位杂交。

1.4 扫描电镜

环巴胺处理的st43期的西伯利亚鲟仔鱼和相应发育时期的对照组用混合固定液(4%PFA和2.5%戊二醛, 用0.1 M PBS稀释) 4℃固定过夜, 再用0.1 mol/L PB于4℃清洗样品6次, 每次15min。梯度酒精(30%—50%—70%—95%)脱水, 每个酒精浓度脱水各5min,最后无水酒精10min。接着CO2临界点干燥, 喷金。最后用S-3400NⅡ扫描电镜观察并拍照。

1.5 FM1-43染色

将st44期西伯利亚鲟仔鱼用PBS冲洗3次, 放入用胚胎水配制的0.1% FM1-43中染色2—5min, 再用胚胎水漂洗3次, 0.05% MS-222 (间氨基苯甲酸酯甲磺酸盐)麻醉, 最后用SMZ-16体视显微镜观察并拍照。

1.6 Hh信号通路相关基因的克隆

我们根据转录组测序中的序列信息, 利用IDT网站上设计引物工具设计了用以扩增Shh、Patched1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)和Gli2四个基因部分编码序列(CDS)的引物(表 1)。我们以西伯利亚鲟胚胎cDNA为模板, 加入设计好的引物, PCR扩增得到这4个基因的cDNA片段, 纯化并连接pBSK载体, 转化DH-5α感受态, 将阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司测序鉴定。

表 1 实验所使用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in the current study

1.7 整体原位杂交

以连有目的基因片段的线性化重组质粒为模板, 用T7或T3 RNA聚合酶合成地高辛(DIG)标记的反义RNA探针。实验前将玻璃容器于180℃高温烘烤6h以上, 溶液用0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过夜。首先将保存于-80℃甲醇中的西伯利亚鲟仔鱼用3% H2O2溶液强光下脱色30min左右, 梯度甲醇(75%—50%—30%)复水, PBST洗涤3次, 每次各5min。再用蛋白酶K(1 μg/mL, sigma)于室温消化10—30min, 新鲜4% PFA固定20min, PBST清洗4次,每次5min。然后将仔鱼转至预杂交液[50%去离子甲酰胺; 5×SSC (pH 7.0); 0.1% Tween20; 500 μg/mL酵母tRNA; 100 μg/mL肝素; 9.2×10-5mol/L柠檬酸]中于65℃孵育3h, 之后换为含探针(0.5 ng/μL)的杂交液65℃孵育过夜。次日依次经梯度2×SSC (25%—50%—75%—100%)稀释的杂交液于65℃轻摇洗涤,各10min; 然后用0.2×SCC洗涤2次, 每次30min; 再经梯度0.2×SSC (75%—50%—25%)轻摇洗涤, 各10min; PBST洗涤1次, 10min。接着用封闭缓冲液[2%羊血清; 2 mg/mL小牛血清白蛋白(BSA)(用PBST配制)]室温封闭仔鱼3h, 再经抗DIG碱性磷酸酶联抗体(按1∶5000用封闭缓冲液稀释)于4℃下轻摇孵育过夜; PBST轻摇洗涤4次, 每次15min; 显色缓冲液[100 mmol/L NaCl; 100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.5); 50 mmol/L MgCl2; 0.1% Tween-20]洗涤3次, 每次5min; 于现配的NBT/BCIP显色液中暗处染色30—60min; PBS洗涤3次, 每次15min; 甲醇洗涤30min; PBS洗涤3次, 每次5min; 新鲜4% PFA室温固定20min; PBS洗涤3次, 每次5min; 最后将仔鱼浸于100%甘油中待SMZ-16体视显微镜观察拍照。

2 结果

2.1 神经丘和壶腹器官转录组中Hh信号通路基因的表达分析

我们的前期工作通过200 μmol/L新霉素破坏st44期西伯利亚鲟仔鱼机械和电感觉毛细胞, 分别建立了0、12h和24h的cDNA文库。我们发现Hh信号通路相关基因Shh、Smoothened、Patched1、Gli2在壶腹器官和神经丘的不同再生阶段中都有表达,我们通过FPKM (Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)对这几个基因的表达进行了比较分析(图 1)。Shh和Patched1的表达均随感觉毛细胞的再生逐渐提高, 24 hpt时, Shh和Patched1在壶腹器官和神经丘的表达量最高, 且 0和24 hpt时在壶腹器官的表达量明显高于神经丘,表达差异显著(图 1a、b)。Gli2和Smoothened的表达在感觉毛细胞再生的3个时间点未明显改变, 仅12 hpt时Gli2基因在神经丘的表达上升, 且在神经丘的表达量明显高于壶腹器官, 表达差异显著(图1c、d)。

2.2 环巴胺处理后神经丘和壶腹器官形态学观察和表面结构变化

将st29期西伯利亚鲟胚胎经20 μmol/L环巴胺处理4d, 在st44期利用普通光学显微镜进行观察, 对照组发育正常而处理组仔鱼较对照组发育迟缓, 眼中晶状体缺失且黑色素沉着较少, 触须缺或变短,上下唇缺失, 卵黄囊较大, 背鳍、尾鳍发育不完整,躯干后部呈弯曲状(图 2)。

为具体阐明环巴胺对西伯利亚鲟仔鱼神经丘和壶腹器官的影响, 我们利用扫描电镜, 观察st43期西伯利亚鲟头部腹面形态结构。与对照组相比, 处理组仔鱼头部腹面受环巴胺影响较大, 口部仅有开口未见唇发育, 触须短到几乎没有(图 3a、b), 这与光镜观察到的结果相似。处理组头部腹面侧线区域神经丘和壶腹器官分布与对照组相比没有明显异常, 也主要分为眶下管和眶下管背腹两侧的壶腹区(图 3c、d)。但神经丘开口明显比对照组小, 且形状不规则(图 3e、f)。处理组头部腹面侧线区域壶腹器官数量明显少于对照组(图 3c、d), 且壶腹器官明显小于对照组, 形状不规则(图 3g、h)。经t test统计学分析显示, 处理组头部腹面壶腹器官数量与对照组相比, 差异及其显著, 而处理组神经丘数量无明显变化(图 3i)。以上结果反映了环巴胺对西伯利亚鲟仔鱼侧线系统表面结构的影响, 我们还利用FM1-43荧光染料标记st44期功能性神经丘, 分析了环巴胺对神经丘的影响。结果表明: 与对照组相比, 环巴胺处理组功能性神经丘数量也无明显差异(图 4a、b)。

图 1 神经丘和壶腹器官再生过程中Hh信号通路相关基因的表达Fig. 1 Gene expression of Hh signaling during hair cell regeneration in neuromasts and ampullary organShh、Patched1、Smoothened、Gli2是与Hh信号通路关键基因; hpt为新霉素处理后时间; FPKM. 每1百万个map上的reads中映射到外显子的每1千个碱基上的片段个数; NM: 神经丘; AO. 壶腹器官; *: P＜0.05; **: P＜0.01Shh, patched1, smoothened and Gli2 is key genes of Hh signaling pathway; hpt for hours post neomycin treatment; FPKM. Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads; NM. neuromast; AO. ampullary organ; *: P＜0.05; **: P＜0.01

图 2 环巴胺对西伯利亚鲟仔鱼(44期)形态的影响Fig. 2 The effect of cyclopamine on the morphology of Siberian sturgeon larva (st44)a. 对照组; b. 环巴胺处理组; e. 眼睛; v. 触须; l. 唇; ys. 卵黄囊; df. 背鳍; tf. 尾鳍; 标尺为1 mma. control group; b. cyclopamine treatment group. e. eye; v. vibrissa; l. lip; ys. yolk sac; df. dorsal fin; tf. tail fin. The scale bar, 1 mm

2.3 Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亚鲟头部的表达

图 3 st43西伯利亚鲟头部腹面观扫描电镜图Fig. 3 The scanning electron micrographs of the ventral view of the head of Siberian sturgeon of stage 43a. 对照组头部腹面观; b. 环巴胺处理组头部腹面观; c, d. 头部腹面左侧放大图(长箭头. 神经丘; 小箭头. 壶腹器官); e, f. 神经丘放大图(长箭头. 神经丘毛细胞); g, h. 壶腹器官放大图(小箭头. 壶腹器官感觉细胞); i. 神经丘和壶腹器官数量统计学分析图; NM. 神经丘; AO. 壶腹器官a. head ventral view of control group; b. head ventral view of cyclopamine treatment group; c, d. higher magnification of the ventral part of the head on the left side (the long arrows refer to neuromasts; head arrows refer to ampullary organs); e, f. higher magnification of the neuromast (the long arrows refer to the hair cells of neuromasts); g, h. higher magnification of the ampullary organ (head arrows refer to the sensory cells of ampullary organs); i. statistical analysis chart of the number of neuromasts and ampullary organs; NM. neuromast; AO. ampullary organ

为了说明环巴胺对西伯利亚鲟仔鱼发育的一系列影响是其作用于Hh信号的结果, 我们通过整体原位杂交分析了Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亚鲟环巴胺处理组和对照组中的表达。结果显示在st32和st36期的西伯利亚鲟中, Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因的表达较为广泛,都在中枢神经系统、听囊、鳃弓和脊索中表达, 与对照组相比, 环巴胺处理组Patched1和Gli2的表达减弱, 而Shh和Smoothened表达未发生变化(图 5 st32, st36)。从st41期开始, 这几个基因的表达量明显下降, 表达范围缩小, 主要集中于眼眶下和上下唇区域。环巴胺处理的西伯利亚鲟Shh基因在腹侧眼眶下区域有微弱表达, 且在上下唇区域强烈表达; Smoothened基因在腹侧眼眶下区域和上下唇区域均有微弱表达。相对对照组, Shh和Smoothened的表达均有所减弱。在环巴胺处理后的仔鱼中, Patched1、Gli2基因在腹侧眼眶下区域和上下唇区域几乎不表达, 均与对照组的表达差异明显(图 5 st41)。

图 4 st44西伯利亚鲟头部腹面观FM1-43荧光染色Fig. 4 Ventral view of the head of Siberian sturgeon by FM1-43 fluorescent staining of stage 44a. 对照组头部腹面观; b. 环巴胺处理组头部腹面观; 箭头表示神经丘; 标尺为0.2 mma. head ventral view of control group; b. head ventral view of cyclopamine treatment group. The arrows label the neuromasts. The scale bar. 0.2 mm

3 讨论

电感受器是一类低等水生脊椎动物特有的感觉器官, 且在系统进化中出现-消失-再出现。本研究以西伯利亚鲟仔鱼为模型, 发现了Hh信号通路基因在两类感受器间的差异表达, 且Hh抑制剂处理特异性降低了壶腹器官的数量, 首次揭示了Hh信号通路与神经丘和壶腹电感受器分化之间的相关性。研究表明: Hh信号可诱导脊髓神经元, 动-静脉血管, 内耳-侧线感觉细胞的分化[9,14,15]。

我们比较了再生过程中壶腹器官和神经丘转录组数据中Hh信号相关基因的差异。其中Shh和Patched1在再生不同阶段动态性表达, 同时在神经丘和壶腹器官两类感觉器官中呈现显著的表达差异(再生中的壶腹器官表达显著高于神经丘)。研究已发现大量的再生调控基因是胚胎发育关键基因的重新激活[16—18], 与之类似, 我们发现Shh信号相关基因同时也在西伯利亚鲟胚胎发育的头部腹面口前区(壶腹集中的一个区域)表达。由于神经丘和壶腹器官紧密相邻, Shh信号在两类感受器发育过程中是否存在差异还有待进一步研究。由于侧线系统中神经丘和壶腹器官在发育过程中难以分辨和解剖, 无法直接分析两类感受器的转录组差异,进而找到它们的分化机制。我们发现通过再生的壶腹器官和神经丘中表达的基因是鉴定发育调控基因的一条有效途径。

为了进一步印证Hh信号途径与壶腹器官发育的关系, 我们利用20 μmol/L环巴胺处理侧线系统发育前(st29)的西伯利亚鲟胚胎。我们发现环巴胺处理导致Hh信号相关基因在st41表达下降, 表明我们所选用的环巴胺处理条件在西伯利亚鲟胚胎中特异的抑制了Hh信号。环巴胺处理后的胚胎表型主要包括晶状体、触须和唇缺失, 背鳍、尾鳍发育不完整, 这与其他研究发现Hh信号参与脊椎动物的晶状体和附肢发育相一致[19,20]。我们在此基础上利用扫描电镜和荧光染料染色, 发现环巴胺还抑制了西伯利亚鲟仔鱼中神经丘的发育, 且对壶腹器官发育的作用更显著。

我们通过整体原位杂交, 在分子水平上分析了Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亚鲟中的表达, 结果表明在st32和st36期的西伯利亚鲟中, Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因的表达较为广泛, 环巴胺处理组Patched1和Gli2的表达减弱, 而Shh和Smoothened表达未发生变化。环巴胺是通过影响Smoothened蛋白的活化而特异性抑制Hedgehog信号, 且环巴胺的直接效应是抑制Hedgehog信号靶基因Patched1和Gli2的表达[13,21]。而从st41期开始, 这几个基因的表达范围缩小, 主要集中于眼眶下和上下唇区域。环巴胺处理的西伯利亚鲟Shh基因在腹侧眼眶下区域有微弱表达, 且在上下唇区域强烈表达; Smoothened基因在腹侧眼眶下区域和上下唇区域均有微弱表达。相对对照组, Shh和Smoothened的表达有稍微减弱, 但差异不明显, 这是由于环巴胺只是抑制smoothened蛋白从而阻断Hh信号通路[13], 而对Shh和Smoothened基因的表达没有太大影响。在环巴胺处理后的仔鱼中, Patched1、Gli2基因在腹侧眼眶下区域和上下唇区域几乎不表达, 均与对照组的表达差异明显, 可能是因为环巴胺直接与smoothened蛋白紧密结合抑制smoothened的活性, 从而抑制下游通路, 这时下游的Gli蛋白在蛋白酶体内被截断, 并以羧基端被截断的形式进入细胞核内, 变成转录阻遏因子, 抑制下游靶基因Patched1、Gli2的转录[13,21]。

我们运用转录组测序分析、整体原位杂交等实验技术, 在分子水平上初步表明了Hedgehog可能参与西伯利亚鲟侧线机械和电感受器的分化。随着近年来CRISPR/Cas9特异基因敲除技术的不断进步, 在西伯利亚鲟中Hedgehog信号通路基因的特异性敲除将为我们提供更有利的证据。

图 5 Shh、Patched1、Smoothened、Gli2基因在西伯利亚鲟头部的表达Fig. 5 The expression of Shh, Patched1, Smoothened and Gli2 in head of Siberian sturgeon st32, st36头部背面观; st41. 头部腹面观或侧面观; cns: 中枢神经系统; ac: 听囊; ba: 鳃弓; n: 脊索; vi: 腹侧眼眶下区域; l: 上下唇区域; 标尺为0.2 mmst32, st36. dorsal view; st41. ventral view or lateral view; cns: central nervous system; ac: auditory capsule; ba: branchial arch; n: notochord; vi: ventral infraorbital field; l: lip. The scale bar. 0.2 mm

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THE INITIAL EVIDENCE FOR HEDGEHOG SIGNALING INVOLVED IN THE DIFFERENTIATION OF MECHANORECEPTORS AND ELECTRORECEPTORS IN THE LATERAL LINE SYSTEM IN SIBERIAN STURGEON

TANG Zhi-Jiao1,2,3, FAN Chun-Xin1,2,3, WANG Jian1,3and SONG Jia-Kun1,2,3
(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Institute for Marine Biosystem and Neurosciences, Institute for Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The lateral line system of some amphibians, all chondrichthyan and non-neopterygian fish is consisted of mechanoreceptors and electroreceptors that are originated from lateral line placodes. However, the molecular mechanism of mechanoreceptor and electroreceptor differentiation remains unclear. Hedgehog is a critical morphogen for pattern formation and stem cell differentiation of multiple organs. In this study, we investigated the relationship between hedgehog signaling and the differentiation of neuromast and ampullary organ in Siberian sturgeon. We found dynamic expression of Shh and Patched1 via the transcriptome analysis in regenerating neuromast and ampullary organ. Furthermore, inhibiting hedgehog signaling by cyclopamine from stage 29 to stage 37 reduced the number of ampullary organs specifically. In addition, cyclopamine repressed the expression of Shh, Patched1, Smoothened, and Gli2 in the ventral region of head. These results indicated that hedgehog signaling was related with the development ampullary organ in Siberian sturgeon.

Siberian sturgeon; Neuromast; Ampullary organ; Hedgehog signaling; Cyclopamine

Q344+.1

A

1000-3207(2017)02-0363-08

10.7541/2017.44

2016-03-15;

2016-06-24

上海海洋大学国际海洋研究中心(A-0209-15-0802); 上海高校水产学一流学科建设项目(A2-2019-14-0001-4); 上海市教委创新项目(12YZ129); 上海海洋大学博士启动基金(A2-0203-00-100314)资助 [Supported by the International Center for Marine Studies, Shanghai Ocean University (Sensory Neurobiology A-0209-15-0802); Shanghai Universities First-class Disciplines Project of Fisheries (A2-2019-14-0001-4); Innovation Program of Shanghai Municipal Education Commission (12YZ129); Shanghai Ocean University Doctoral Scientific Research Foundation]

唐智娇(1990—), 女, 江西赣州人; 硕士研究生; 主要研究方向为神经发育生物学。E-mail: zjtang2016@163.com

范纯新, E-mail: cxfan@shou.edu.cn