灭活酵母对干红葡萄酒酚类物质及其抗氧化活性的影响

李俊娥，张金宏，吴正，樊明涛，魏新元

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨陵712100）

灭活酵母对干红葡萄酒酚类物质及其抗氧化活性的影响

李俊娥，张金宏，吴正，樊明涛，魏新元*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨陵712100）

以河北省昌黎县华夏长城葡萄园的赤霞珠葡萄所酿干红葡萄酒为研究对象，设计4种不同的试验处理，测定葡萄酒中酚类物质含量及其抗氧化活性，研究灭活酵母对葡萄酒中酚类物质含量及其抗氧化活性的影响。试验结果显示，第5天添加灭活酵母3 g/L（处理1）的葡萄酒中总酚、总花色苷和总单宁的含量最高；单体酚含量测定时，第25天添加灭活酵母3g/L（处理3）的葡萄酒中咖啡酸、绿原酸、芦丁、（+）-儿茶素、鞣花酸和没食子酸含量最高；不同处理下样品的总还原能力、DPPH·清除率和ABTS+·清除率都有不同程度的提高。因此，灭活酵母能提高赤霞珠干红葡萄酒中酚类物质的含量，增强其抗氧化活性。

灭活酵母；葡萄酒；酚类物质；抗氧化活性

酚类化合物是指苯环上的氢原子被羟基取代生成的化合物，根据所含羟基数目的不同，酚类化合物分为一元酚和多元酚。酚类化合物中的羟基能和生物体内物质的氧自由基发生反应，从而保护生物细胞免受氧化作用，具有提高机体免疫力和抗衰老等功能，也具有降低多种慢性病和冠心病发病率的作用[1-2]。酚类化合物呈弱酸性，具有特殊的芳香气味。自然界中存在的酚类化合物大都是植物生命活动的产物。葡萄中含有的大量酚类物质是葡萄酒的重要成分之一，它能影响葡萄酒的品质和口感，是评价葡萄酒品质的重要指标之一。有研究证实，葡萄酒中的酚类物质与其抗氧化活性呈正相关[3-5]。影响葡萄酒中酚类物质含量的因素有很多，如葡萄的品种与产地、气候和土壤因素、葡萄的成熟度以及发酵过程中的添加物等，其中品种是影响葡萄酒酚类物质含量的决定性因素[6-10]。现如今有多种品质优良的酿酒葡萄用于葡萄酒生产，且工艺技术非常成熟，如何在现有基础上进一步提升葡萄酒的生产工艺，改善葡萄酒品质是当前的研究热点。

葡萄酒酿制过程中，酵母菌株的选择非常重要，它一方面决定了自身的酒精发酵能力，另一方面影响葡萄酒的其他品质，如香气和口感等。酵母细胞中干物质约占25%，其中酵母多糖约占干重的40%[6，11]。酵母多糖主要由葡聚糖、甘露聚糖和少量的几丁质组成，具有良好的生物活性，会对葡萄酒的香气产生有益的影响。有研究显示，酵母多糖能增加葡萄酒的香气成分，能降低其酸涩度，提升圆润度，增加饱满性[11-13]。有关酵母多糖对葡萄酒中酚类物质含量及抗氧化活性影响的研究较少，且酵母多糖不易提取并提纯，商业化的酵母多糖产品很少。因此，本研究拟直接将酿酒酵母灭活后应用于赤霞珠干红葡萄酒酿制，研究其对酒中酚类物质含量和抗氧化能力的影响，探索提高葡萄酒品质的新途径。

1材料与方法

1.1材料

葡萄：赤霞珠葡萄，产自河北省昌黎县华夏长城葡萄园（2015年）。

菌株：酿酒酵母菌株F-15，乳酸菌XJ-25，均为西北农林科技大学食品科学与工程学院微生物发酵实验室保藏。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

标准品（阿魏酸、槲皮素、咖啡酸、绿原酸、芦丁、（+）-儿茶素、鞣花酸、没食子酸）：购于美国o2si；单宁酸：天津天力化学试剂有限公司；DPPH：购于日本东京化成工业株式会社（TCI）；福林酚、ABTS（现配现用）、蜗牛酶（破壁率达90%以上）：购于北京索莱宝科技有限公司；色谱级乙腈、色谱级甲醇、色谱级乙酸：购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2.2仪器

UV-1240紫外分光光度计：日本岛津公司；SHBIII循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3试验方法

1.3.1灭活酵母的制备

活化酵母菌株F-15后将其接种于YPD培养基中扩大培养至稳定初期，80℃下加热20min，洗涤并离心收集细胞沉积物，将沉淀物进行真空干燥，然后于-20℃贮存备用。

灭活酵母用前制备：将酵母干粉溶于pH 6.5的Tris-HCl缓冲液中，加入1.5%蜗牛酶，37℃酶解2 h后于80℃加热15min，冷却至室温备用。

1.3.2葡萄酒酿制与灭活酵母的添加

挑选完整饱满、色泽良好的赤霞珠葡萄，除梗、破碎后按发酵罐体积的80%装入1 L发酵罐，接入2%体积的酿酒酵母F-15进行常温浸渍发酵20 d。酒精发酵结束后接入2%体积的乳酸菌XJ-25进行苹果酸-乳酸发酵，葡萄酒陈酿31 d后测定各项指标。本试验设计了4种不同处理方法，分别为：酿制第5天添加灭活酵母3 g/L（处理1），第15天添加灭活酵母3 g/L（处理2），第25天添加灭活酵母3 g/L（处理3）[11，14-15]，以同等条件下不添加灭活酵母制得的葡萄酒作为对照。试验设置2个生物重复，各指标平行测定3次，结果以平均值表示。

1.3.3酚类物质的测定

1.3.3.1总酚物质含量测定

总酚含量测定采用福林-肖卡比色法[16]，以每升葡萄酒中的没食子酸含量表示。

总单宁含量测定采用福林-丹尼斯试剂法[17-19]，以每升葡萄酒中的单宁酸含量表示。

总花色苷含量测定采用pH值示差法[20]，以每升葡萄酒中的矢车菊素-3-葡萄糖苷含量表示。

1.3.3.2单体酚种类和含量测定

取100mL葡萄酒用80mL乙酸乙酯重复萃取3次，合并有机相并在33℃下避光蒸干，残留物用色谱级甲醇定容至5mL。测定前样品需用0.22μm微孔滤膜过滤[21]。

选用WondaSil反相C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱[22]。采用二元梯度洗脱：流动相A为水∶乙酸（98∶2，体积比），流动相B为乙腈。洗脱程序：0～20min，20% B；20 min～25 min，50%B；25 min～30 min，70%B；30 min～35min，80%B；35min～40min，20%B。流速1.0mL/min，进样量10μL，柱温30℃，采用Diode Array Detector（DAD）检测器采集280 nm特征波长下的信号。

1.3.4葡萄酒抗氧化活性的测定

DPPH自由基清除能力的测定参考Li等[23]的方法，葡萄酒样品稀释3倍后测定其DPPH自由基清除率，结果以自由基清除率（%）表示；ABTS+·自由基清除能力的测定参考Xu等[24]的方法，样品稀释8倍后测定ABTS清除率，结果以自由基清除率（%）表示；总还原能力的测定参考Tagliazucchia等[25]的方法，样品稀释3倍后测定其吸光值，结果以样品的吸光值表示，吸光值越低其总还原能力越强。

1.4数据处理与分析

采用Data Processing System（DPS）v 6.55 Tukey法进行显著性差异分析。

2结果与分析

2.1灭活酵母对葡萄酒酚类物质含量的影响

分别测定不同处理条件下葡萄酒中的总酚、总花色苷和总单宁物质的含量，结果见表1。

表1 葡萄酒中酚类物质的含量Table1 The contentofphenolic substances in wineunder different treatmentsa

由表1可知，与对照相比，用不同方法处理的赤霞珠干红葡萄酒中酚类物质含量有不同程度的提高，其中处理1葡萄酒中总酚含量、总花色苷和总单宁含量最高，分别为：1.076 1 g/L、0.131 7 g/L和1.516 8 g/L。处理2葡萄酒中的总酚和总单宁含量高于处理3，而在处理3葡萄酒中总花色苷的含量高于处理2。试验结果显示，葡萄酒中总酚和总单宁含量从大到小依次为：处理1＞处理2＞处理3＞对照；总花色苷含量从大到小依次为：处理1＞处理3＞对照＞处理2。综上所述，处理1（第5天添加灭活酵母3 g/L）能增加赤霞珠干红葡萄酒中酚类物质的含量。

为了探究葡萄酒中单体酚物质的种类和含量，利用HPLC从葡萄酒中鉴定出8种单体酚物质如图1B所示，根据8种单体酚标准混合溶液的图谱（图1A）作出各单体酚的线性方程，如表2所示。

图1 混合标准溶液（A）和对照葡萄酒（B）随时间变化色谱图Fig.1 HPLC chrom atogram ofm ixed standard solution（A）and HPLC chromatogram of controlw ine（B）

表2 8种单体酚的线性回归方程Table2 The liner regression equation for eightkindsof freephenols

根据表2线性回归方程计算得不同处理葡萄酒中8种单体酚含量如表3所示。

表3 不同处理葡萄酒中8种单体酚含量Table3 The contentofeightkindsof free phenolsunder several treatmentsin wine mg/L

由表3可知，不同处理方法对干红葡萄酒中8种单体酚含量影响效果不一。灭活酵母的添加使得各单体酚物质的含量从大到小呈现以下现象：阿魏酸，对照＞处理3＞处理2＞处理1；槲皮素，处理1＞对照＞处理3＞处理2；咖啡酸、芦丁和没食子酸，处理3＞对照＞处理2＞处理1；绿原酸和（+）-儿茶素，处理3＞处理2＞对照＞处理1；鞣花酸，处理1＞处理3＞处理2＞对照；8种单体酚总含量，处理3＞对照＞处理2＞处理1。葡萄酒中（+）-儿茶素的含量较高，尤其处理3葡萄酒（+）-儿茶素的含量最高为10.246 8 mg/L，占单体酚总量的40.81%；葡萄酒中槲皮素的含量很低，处理2葡萄酒中槲皮素含量最低为0.221 6mg/L，占单体酚总量的1.10%；葡萄酒中单体酚含量次高的为没食子酸，处理3葡萄酒中没食子酸含量为4.326 8mg/L，比对照高0.488 2mg/L，但处理1和处理2中没食子酸含量有所下降。和对照葡萄酒相比，槲皮素和鞣花酸在处理1葡萄酒中含量最高，处理2葡萄酒中绿原酸、（+）-儿茶素和鞣花酸的含量有不同程度增加，但另外5种单体酚的含量有所降低，处理3酒中除槲皮素和阿魏酸外的单体酚物质含量增加。

葡萄酒中单体酚物质含量变化复杂，这可能由灭活酵母与各单体酚物质的相互作用不同造成的，也可能是不同处理方法使单体酚发生了不同程度的变化。

综上所述，灭活酵母的添加对酒中单体酚物质的含量产生了影响，第25天添加灭活酵母3 g/L（处理3）能提高赤霞珠干红葡萄酒中单体酚物质的含量。

2.3葡萄酒抗氧化活性的比较

生物体中存在复杂的自由基和抗氧化剂，因此评定生物体抗氧化性能的工作强度很大，现阶段的相关研究通常是将两种或两种以上的抗氧化测试方法结合起来，以提高测定结果的准确性和客观性[26]。本试验中将总还原能力、DPPH和ABTS三种方法结合起来研究灭活酵母添加对赤霞珠干红葡酒抗氧化活性的影响，结果如图2。

图2 不同处理葡萄酒的总还原能力（A）、DPPH·清除率（B）和ABTS+·清除率（C）Fig.2 The total reducing capacity（A），DPPH·clearance（B）and ABTS+·clearance（C）ofw inewith different treatments

图2A显示，不同处理下干红葡萄酒的总还原能力无显著性差异，但处理1、处理2和处理3样品的吸光值小于对照，表明添加灭活酵母能提高葡萄酒的还原能力，但效果不明显。图2（B）和图2（C）显示，不同处理葡萄酒的DPPH·和ABTS+·清除率有显著性差异，样品的自由基清除率由大到小依次为：处理1＞处理3＞处理2＞对照。

酒样稀释3倍后测得的DPPH·清除率最高为81.20%，和对照相比提高了6.70%；处理2和处理3葡萄酒的DPPH·清除率分别为76.02%和78.53%，各提高了1.52%和4.03%。用ABTS法测定样品的自由基清除率发现，处理1样品的清除率最高为85.50%，处理2和处理3样品的清除率分别提高到81.36%和81.87%。因此，灭活酵母添加对葡萄酒的DPPH和ABTS+·清除率产生了积极的影响。

3种测定葡萄酒抗氧化活性的方法具有较好的相互支撑作用。试验结果表明，3种处理方法均能提高赤霞珠干红葡萄酒的抗氧化活性。处理1葡萄酒的抗氧化活性最好，即第5天添加灭活酵母3 g/L，葡萄酒的抗氧化活性最强。

3结论

1）第5天添加灭活酵母3 g/L的葡萄酒中总酚、总花色苷和总单宁含量最高，灭活酵母能显著提高赤霞珠干红葡萄酒的抗氧化活性，葡萄酒的酚类物质含量和抗氧化活性得到最佳改善。

2）咖啡酸、绿原酸、芦丁、（+）-儿茶素、鞣花酸、没食子酸在第25天添加灭活酵母3 g/L的葡萄酒中含量最高，这与1）中结果不一致，可能与葡萄酒中其它未检测的单体酚物质含量有关，具体原因有待进一步研究。

3）灭活酵母能改善赤霞珠干红葡萄酒品质，可作为添加剂用于葡萄酒的酿制。

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Influence of Inactivated Yeast on Phenolic Com pounds and Antioxidation of Red W ine

LIJun-e，ZHANG Jin-hong，WU Zheng，FANMing-tao，WEIXin-yuan*
（Collegeof Food Scienceand Engineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，Shaanxi，China）

The study used Cabernet Sauvignon produced in Changlicounty of Hebeiprovince asmaterial.And the changes of content of phenolic compounds and antioxidant activity were researched through four different treatments inwine.The results indicated that the highestcontentof total phenol，totalanthocyanin and total tannin ofwine affected by processing 1（3 g/L of inactivated yeast at 5 th day）and the contentof caffeic acid，chlorogenic acid，rutin，（+）-catechin，ellagic acid and gallic acid in processing 3（3 g/L of inactivated yeastat 25 th day）behaved maximum.Among the antioxidation activity assay，the reducing power，DPPH·and ABTS+·clearance rate had raised varying degrees.Thus，the inactivated yeast can increasing the content of phenolsubstances in CabernetSauvignonwine and improving itsantioxidantactivity.

inactived yeast；wine；phenolics；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.030

2016-06-14

现代农业技术产业体系-葡萄产业体系（CARS-30gj-3）

李俊娥（1991—），女（汉），硕士研究生，主要从事食品高新技术研究。

*通信作者：魏新元（1971—），男（汉），副教授，主要从事食品安全及食品高新技术研究。