草鱼鱼鳞胶原蛋白提取及活性肽制备研究

贺江，赵自龙，彭磊，杨浩，黄冰

（湖南文理学院生命科学学院，环洞庭湖水产健康养殖与加工湖南省重点实验室，湖南省水产高效健康生产协同创新中心，湖南常德415000）

草鱼鱼鳞胶原蛋白提取及活性肽制备研究

贺江，赵自龙，彭磊，杨浩，黄冰

（湖南文理学院生命科学学院，环洞庭湖水产健康养殖与加工湖南省重点实验室，湖南省水产高效健康生产协同创新中心，湖南常德415000）

以草鱼鱼鳞为原材料，探讨其胶原蛋白酸-酶组合提取工艺，并进一步研究相应抗氧化活性肽和血管紧张素转换酶抑制（ACEI）活性肽的制备方法。结果表明，草鱼鱼鳞胶原蛋白提取的最优工艺为：乙酸浓度0.3mol/L、乙酸提取固液比1∶15（g/mL）条件下低温下提取24 h；离心后剩余残渣再按1∶10（g/mL）的比例浸入浓度为2%的胃蛋白酶溶液中低温下提取48h；在该条件下鱼鳞胶原蛋白提取得率可达49.58%。以草鱼胶原蛋白粗提液为原料，制备抗氧化活性肽的最优工艺为：控制胶原蛋白浓度12.5mg/mL，按10∶1（体积比）的比例加入浓度为4%的木瓜蛋白酶，60℃下酶解75min，所得酶解液对ABTS+自由基的抑制率可达45.7%；制备ACEI活性肽的最优工艺为：控制胶原蛋白浓度20mg/mL，pH值调节为4.0，每10mL加入6000U的酸性蛋白酶，37℃酶解3 h，所得酶解液对血管紧张素转换酶（ACE）的抑制活性可达98.8%。本研究结果，有望为水产品加工副产物的资源化利用提供参考。

鱼鳞；胶原蛋白；抗氧化肽；血管紧张素转换酶抑制肽

我国水养殖业近年来发展迅速，产量已位居世界首位；水产品加工业是水产养殖业的延伸，也是进一步推动水产养殖业健康发展的关键所在。对于草鱼、鳙鱼等主养淡水鱼的加工，目前已经取得了较大的发展，冷鲜鱼、速冻鱼片、鱼糜系列产品的产业化生产已呈现规模；但在这些淡水鱼类的加工过程中，往往会产生出占鱼体总重约40%～55%的下脚料（包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉等）。目前，这些加工副产物主要被用来生产饲料鱼粉，但实际上其中还含有一系列较有价值的成分可以挖掘。

胶原蛋白提取以及各类生物活性肽的开发，是当前水产加工副产物综合开发利用研究的热点之一[1-3]。但现有研究主要集中于海洋鱼类或近海鱼类，针对主养淡水鱼及其加工废弃物中的胶原蛋白提取工艺及生物活性肽制备相关研究较少。就胶原蛋白的提取而言，其工艺方法包括酸法[4-5]、碱法[6]、酶法[7-8]和热水抽提法[9-10]等多种，但每种方法均有其优势和不足，所以目前的趋势将两种甚至多种提取方法进行组合，以提高提取得率。在生物活性肽的制备方面，虽然在抗氧化和降血压活性肽的制备、纯化，以及结构分析等方面已经开展了一系列工作，但针对生物活性肽的制备工艺进行优化研究，进而提高制备效率，仍然是一项有价值的工作。

基于上述背景，本研究以草鱼鱼鳞为原料，采用酸-酶组合提取工艺进行胶原蛋白提取，并进一步进行抗氧化活性肽和降血压活性肽的制备，通过对相关工艺参数进行优化，以期为生产实际提供一定的参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜草鱼鱼鳞（取自常德当地农贸市场）：将鱼鳞清洗干净，放入0.5mol/L稀盐酸溶液中浸泡，去除鱼鳞中的金属离子，处理完成后用水冲洗，捞出后用清水洗涤至中性，最后烘干、剪碎备用。胃蛋白酶（3.0× 103U/mg）：上海化学试剂公司；中性蛋白酶（6.0×104U/ g）：无锡杰能科酶制剂公司；碱性蛋白酶（2.0×105U/ g）：丹麦诺维信公司；酸性蛋白酶（5.0×104U/g）：上海生物试剂公司；血管紧张素转化酶（1.4×103U/g）、木瓜蛋白酶（≥10U/mg）、2，2-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）（G.R）、Hip-His-Leu（分析纯）、卡托普利（分析纯）：美国sigma公司；考马斯亮兰蛋白含量测定试剂盒：上海荔达生物科技有限公司；马尿酸（分析纯）：上海展云化工有限公司；其他常规试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

UV-2550型紫外-可见分光光度计：日本岛津；PL303型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TGL-16G型高速离心机：上海安亭科学仪器厂；P680型高效液相色谱仪：美国戴安公司；其他常规仪器和玻璃器皿。

1.3方法与步骤

1.3.1鱼鳞胶原蛋白的酸-酶组合提取工艺

准确称取1.00 g预处理过的鱼鳞样品，加入一定浓度的适量乙酸溶液，然后在低温下提取24 h；将酸提液于8 000 r/min条件下离心20min，收集上清液；剩余残渣按1∶10（g/mL）的比例浸入一定浓度的适量胃蛋白酶溶液中，低温下提取48h；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白粗制液。本试验旨在提取非变性胶原蛋白，因此提取温度控制在15℃左右。

采用考马斯亮兰蛋白含量测定试剂盒测定胶原蛋白粗制液的蛋白浓度，按如下公式计算胶原蛋白提取得率，并以提取得率为观测指标进行提取工艺参数的优化。

式中：W为胶原蛋白提取得率，%；C为胶原蛋白浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；M为鱼鳞样品重量，g。

1.3.2抗氧化活性胶原蛋白肽的制备工艺

以1.3.1所获得的鱼鳞胶原蛋白粗制液为原料，将其调节至一定浓度后调节pH值至6.0；然后取10mL该胶原蛋白溶液加入1mL一定浓度的木瓜蛋白酶；在60℃下酶解一定时间后，将其置于100℃的沸水中处理10min灭酶；最后，将酶解液于4 000 r/min条件下离心20min，并收集上清进行抗氧化活性测定。

参照文献[11]，采用ABTS法测定胶原蛋白酶解液的体外抗氧化活性（自由基清除率），并以此为指标进行酶解工艺参数的优化。

1.3.3降血压活性胶原蛋白肽的制备工艺

以1.3.1所获得的鱼鳞胶原蛋白粗制液为原料，调整浓度为20mg/L，再取3份分别将其pH值调节至4.0、7.0、9.0；然后各取10mL分别加入相同酶活单位（6 000 U）的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶并混合；将混合液置于37℃恒温水浴锅内保温酶解3 h后，取出反应液并置于100℃的沸水中处理10min灭酶；最后，将酶解液于4 000 r/min条件下离心20min，并收集上清进行降血压活性测定。

参照文献[12]，采用HPLC法测定胶原蛋白酶解液的血管紧张素转换酶抑制活性（ACEI活性），并以此为指标进行最佳酶解工艺参数的优化。

2结果与分析

2.1草鱼鱼鳞胶原蛋白提取工艺

本研究采用酸-酶组合提取工艺对草鱼鱼鳞胶原蛋白进行提取，在单因素试验的基础上，本研究选定乙酸浓度、乙酸提取固液比、胃蛋白酶浓度作为主要影响因素，采用正交试验设计对鱼鳞胶原蛋白酸-酶组合提取工艺参数进行优化，优化试验结果如表1。

表1 胶原蛋白提取工艺正交试验优化结果Table1 Optim ization resultsoforthogonal test for the collagen extraction process

由表1可知，在所考查的3个因素中，对草鱼鱼鳞胶原蛋白提取得率的影响大小顺序为酶浓度＞乙酸浓度＞乙酸提取固液比；而所考察的3个因素的最优参数组合为乙酸浓度0.3mol/L、乙酸提取固液比1∶15（g/mL）、酶浓度2%，在该条件下鱼鳞胶原蛋白提取得率为49.58%。

2.2抗氧化活性胶原蛋白肽制备工艺

本研究以鱼鳞胶原蛋白粗提液为原料，利用木瓜蛋白酶对其进一步酶解以制备高抗氧化活性和降血压活性的胶原蛋白肽。试验选择鱼鳞胶原蛋白的底物浓度、酶浓度、以及木瓜蛋白酶的酶解时间3个关键因素，采用正交试验设计对工艺参数进行优化，优化试验结果如表2。

表2 抗氧化活性胶原蛋白肽制备工艺正交试验优化结果Table2 Optim ization resultsof orthogonal test for theprocessof antioxidativepeptide preparation

续表2抗氧化活性胶原蛋白肽制备工艺正交试验优化结果Continue table2 Optim ization resultsof orthogonal test for the processof antioxidative peptidepreparation

由表2可知，所考察的各因素对ABTS+自由基清除率的影响次序为：底物浓度＞酶解时间＞酶浓度；经方差分析可知，底物浓度对ABTS+自由基清除率的影响达到显著水平。对上表进行直观分析可知，抗氧化活性胶原蛋白肽的最佳制备工艺参数为，底物浓度12.5mg/mL、木瓜蛋白酶浓度4%、反应时间75min；经进一步验证，在该工艺参数组合下，胶原蛋白酶解液的ABTS+自由基抑制率可达45.7%，与未经处理的胶原蛋白粗提液（ABTS+自由基抑制率为7.9%）相比，有显著提高。

2.3降血压活性胶原蛋白肽制备工艺

本研究利用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶分别处理鱼鳞胶原蛋白粗提液样品，得到3种酶解产物，酶解后将各酶解液的pH值调至中性；以0.1mol/L硼酸缓冲液为空白对照，未经酶解处理的样品为阴性对照，参照文献[12]所述方法对样品进行处理，利用HPLC法测定各样品中马尿酸的含量后计算出各样品的血管紧张素转换酶抑制活性（ACEI），结果如表3所示。

表3 草鱼鱼鳞胶原蛋白经不同蛋白酶酶解后ACEI活性比较Table3 The ACEIactivity of grass carp fish scale collagen enzym olysised by different protease

由表3可知，未经酶解处理的胶原蛋白粗提液对血管紧张素转化酶的抑制活性为44.46%，这是由于在酸-酶提取过程中，胶原蛋白发生了部分水解，生产的小分子多肽表现出一定的血管紧张素转换酶抑制活性。经不同蛋白酶酶解处理后，酶解液的ACEI活性均明显提高，其中酸性蛋白酶酶解液的ACEI活性最高，达98.78%。因此，酸性蛋白酶是利用草鱼鱼鳞胶原蛋白制备降血压活性肽的最佳酶制剂。

3讨论与结论

食物源生物活性肽的制备是近年来国内外的研究热点，以水产品加工副产物为原料进行生物活性肽的制备则具有显著的实际意义。本研究以草鱼鱼鳞为原料，采用酸-酶组合提取工艺对其胶原蛋白进行提取，并在此基础上探讨了抗氧化活性肽和血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽的制备，所获研究结果，可为水产品加工副产物的资源化利用提供一定参考。进一步的研究可从活性肽的分离纯化、结构鉴定、活性机理等方面着手。

本研究结果表明，草鱼鱼鳞胶原蛋白酸-酶组合提取的最优工艺为：乙酸浓度0.3mol/L、乙酸提取固液比1∶15（g/mL）条件下低温下提取24 h；离心后剩余残渣再按1∶10（g/mL）的比例浸入浓度为2%的胃蛋白酶溶液中低温下提取48 h；在该条件下鱼鳞胶原蛋白提取得率可达49.58%。以草鱼胶原蛋白粗提液为原料，制备抗氧化活性肽的最优工艺为：控制胶原蛋白浓度12.5mg/mL，按10∶1（体积比）的比例加入浓度为4%的木瓜蛋白酶，60℃下酶解75min，所得酶解液对ABTS+自由基的抑制率可达45.7%；制备ACEI活性肽的最优工艺为：控制胶原蛋白浓度20mg/mL，pH值调节为4.0，每10mL加入6 000U的酸性蛋白酶，37℃酶解3 h，所得酶解液对ACE的抑制活性可达98.78%。

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[2]郭玉华,刘扬瑞,李钰金.鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展[J].中国食品添加剂,2010(3):175-179

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Extraction of Collagen from Fish Scale of Grass Carp and Preparation of Bioactive Peptide

HE Jiang，ZHAOZi-long，PENGLei，YANGHao，HUANGBing
（Collegeof Life Science，Hunan University ofArtand Science/Hunan Provincial Key LaboratoryofAquatic Healthy Farmingand Processing in Dongting Lake/Collaborative Innovation Center forEfficientand Healthy Production of Fisheries in Hunan Province，Changde415000，Hunan，China）

Fish scale ofgrass carp was used as row material for collagen extraction，and then the extractswere used for antioxidative peptide and angiotensin converting enzyme inhibitory peptide preparation.The optimal processofcollagen extractionwasas follow：acetic acid（0.3mol/L）wasaddedwith the ratioof1∶15（g/mL）and extracted for 24 h under low temperature，then centrifugated and the residueswere further extracted for 48 hoursby2%proteasewith the ratioof1∶10（g/mL）.By thisprocess，theextraction rateofcollagenwas49.58%. The optimal process ofantioxidative peptide preparation was as follow：collagen concentration was adjusted to 12.5mg/mL，4%papain solution wasadded with the volume ratio of10∶1，and then enzymatic hydrolysis for 75minutesunder 60℃.The inhibition ratio of the end product to ATBS+free radicalwas45.7%.The optimal process of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide preparation was as follow：collagen concentration was adjusted to 20mg/mL and pH to 4.0，6 000 U acid proteinasewas added to 10mL collagen solution，and then enzymatic hydrolysis for3 hoursunder37℃.The inhibition ratio of the end product to angiotensin converting enzymewasup to 98.8%.These results can provide some reference for resource utilization of the byproducts ofaquatic productprocessing.

fish scale；collagen；antioxidativepeptide；angiotensin convertingenzyme inhibitorypeptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.012

2016-06-15

湖南省常德市联合基金项目（2015JJ5008）；国家自然科学基金项目（31401583）

贺江（1983—），男（汉），副教授，博士，主要从事食品安全与食品生物技术方面的研究。