金银花、银杏叶总黄酮协同清除DPPH自由基作用研究

石艳宾

（天津天狮学院，天津301700）

金银花、银杏叶总黄酮协同清除DPPH自由基作用研究

石艳宾

（天津天狮学院，天津301700）

采用超声辅助法提取金银花、银杏叶总黄酮，以DPPH自由基清除能力为评价指标，分析两种黄酮提取物的协同抗氧化性。试验结果表明，金银花、银杏叶总黄酮对DPPH自由基具有明显的清除作用，且半数清除率（IC50）分别为58.14μg/mL和61.32μg/mL。由Isobologram分析得到两种物质复配后的效应点均在相加线和95%置信区的左侧，试验IC50mix与理论IC50add存在显著性差异，相互作用指数（γ）均小于1，表明二者复配可以增强清除DPPH自由基效果。金银花总黄酮与银杏叶总黄酮复配比（以下所有复配比均指质量比）为1∶9时，γ为0.71，协同清除DPPH自由基的相互作用效果最好。

金银花；银杏叶；总黄酮；DPPH；协同抗氧化

黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，金银花总黄酮、银杏叶总黄酮能有效消除自由基，保护机体不受损伤。大多数黄酮类化合物与糖结合形成苷类存在于植物体内，少部分则以游离的苷元形式存在，具有抗炎症、解热、抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗氧化等生物活性[1]。金银花甘寒清热而不伤胃，临床用于热血毒痢、风热感冒、咽喉肿痛等[2-3]。银杏叶具有活血化瘀、通络止痛、抗炎、抗氧化等方面的作用[4-5]，与黄芪复方提取物具有明显增强机体免疫和细胞免疫的作用[6]。目前，对金银花总黄酮、银杏叶总黄酮单独的抗氧性研究较多，而对二者协同抗氧化性能研究的较少。本试验采用超声辅助法提取金银花、银杏叶总黄酮，采用DPPH试验法测定金银花、银杏叶总黄酮的自由基清除能力，研究二者之间是否存在协同增效作用，为寻找高效复合型天然抗氧化剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

金银花、银杏叶：采购于药店，粉碎过100目筛冷藏备用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：sigma公司；芦丁标准品：合肥博美生物技术有限公司；抗坏血酸、无水乙醇、无水甲醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠（分析纯）：天津江天化工技术有限公司。

1.2仪器与设备

SB-300DTD粉碎机：上海永久中药机械制造有限公司；BSA 124S精密电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV1000紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；TG16KR高速离心机：长沙东旺试验仪器有限公司；SB3200DTDN超声波清洗机：新芝生物科技股份有限公司；ME204分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；DH-101电热恒温鼓风干燥箱：天津市中环实验电炉有限公司。

1.3方法

1.3.1总黄酮的提取

分别准确称取5 g已处理好的金银花和银杏叶样品，置于250 mL锥形瓶中，在锥形瓶中加入125mL 70%乙醇溶液。将样品和乙醇溶液混合均匀，放置在超声波处理器中，在60℃、功率450W条件下，超声浸提30min，冷却至室温。在3500 r/min转速下离心10min，得总黄酮提取液，至棕色广口瓶内，并保存于4℃冰箱中贮藏待用[4]。

1.3.2总黄酮含量的测定

精密移取0.410mg/mL芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL棕色容量瓶中，加入1mL质量浓度为5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置反应6min；加入1mL浓度为10%硝酸铝溶液，摇匀，静置反应6min；加入4mL浓度为1mol/L氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至25mL，振荡摇匀，并放置10min，待测[4]。以试剂空白为参比，在510 nm处测定芦丁标准品溶液反应后的吸光度值（A）。以芦丁标准品浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程，并以此为依据计算金银花、银杏叶总黄酮提取液的浓度。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的测定

用移液管准确移取一定浓度金银花、银杏叶总黄酮提取物液0.2mL，分别置于10mL棕色比色管中，加入6mL浓度为0.06mmoL/LDPPH自由基甲醇溶液，加入甲醇定容至10mL，振荡摇匀，室温避光反应30min后，在波长517nm处测定吸光度A[7]。依据公式1计算金银花、银杏叶总黄酮单独作用及复配作用对DPPH自由基的清除率。

式中：A0为未加总黄酮提取液的DPPH自由基溶液反应的吸光度；Ar为加入总黄酮提取液的DPPH自由基溶液反应的吸光度；Ax为待测总黄酮提取液本底吸光度。

1.3.4金银花、银杏叶总黄酮复配清除DPPH能力的测定

以金银花、银杏叶总黄酮单独作用的IC50为参考，确定两种黄酮提取物的浓度。将黄酮提取液稀释成122μg/mL，按金银花与银杏叶总黄酮复配比为1∶1、1∶3、1∶9、3∶1、9∶1进行混合[8-9]，按照1.3.3方法测定复配混合溶液对DPPH自由基的清除率，应用Sigmaplot12绘制Isobologram分析图，对复配混合物的协同清除DPPH自由基能力进行分析。

1.4统计学分析

由实验得到复配溶液实际的半数清除率IC50mix，采用t检验法对复配溶液的IC50add和IC50mix进行比较分析，确定是否有显著性差异。若IC50mix＜IC50add值，表示二者具有协同作用[10-11]。

式中：P1为金银花总黄酮在复配组中占的比例；P2为银杏叶总黄酮在复配组中占的比例，P2=1-P1；R为金银花、银杏叶总黄酮单独作用时的效价比，即R= IC50A/IC50B。

为表示金银花总黄酮与银杏叶总黄酮相互作用程度的大小，计算相互作用指数（γ），分析二者协同或拮抗作用的大小[11]。

式中：IC50Amix、IC50Bmix分别为复配溶液中金银花、银杏叶总黄酮的半数清除率IC50；IC50A、IC50B分别为抗氧化剂金银花总黄酮、银杏叶总黄酮单独作用时的IC50。若相互作用指数γ=1，表示金银花、银杏叶总黄酮间相互作用为相加；若γ＞1，表示两者间相互作用为拮抗；若γ＜1，表示两者间为协同作用。

2结果与分析

2.1黄酮提取液浓度的测定

根据芦丁标准曲线，得线性回归方程y=0.007 3x+ 0.007 8（R2=0.999 0），表明浓度在0～98.4μg/mL之间有良好的线性关系。准确移取稀释后的黄酮提取液1 mL，按照上述方法测定吸光度值A，根据线性回归方程计算金银花、银杏叶总黄酮提取液的浓度分别为4 626.7μg/mL和3 051.37μg/mL。

2.2金银花、银杏叶总黄酮清除DPPH自由基的能力

依据1.3.4所描述的方法，配制不同浓度VC、金银花总黄酮、银杏叶总黄酮样品溶液，测定各个样品溶液的DPPH反应吸光度值，计算VC、金银花总黄酮、银杏叶总黄酮对DPPH自由基的清除率，DPPH清除率试验结果见图1。

图1 3种样液对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH scavenging capacity of differentantioxidants

由图1可以看出，在一定浓度下，DPPH自由基清除率随着有效浓度的增大而呈现上升的趋势，但当达到一定的浓度后，这种变化不明显且逐渐趋于平缓。以IC50为衡量指标，比较金银花、银杏叶总黄酮提取物与VC单独对DPPH自由基的清除率，则三者对DPPH自由基清除能力大小分别为VC（IC50=22.01μg/mL）＞金银花总黄酮（IC50=58.14μg/mL）＞银杏叶总黄酮（IC50= 61.32μg/mL）。半数清除率越低，表明该种物质对DPPH自由基的清除能力越强，反之越弱。

2.3金银花、银杏叶总黄酮复配清除DPPH自由基的能力

以金银花、银杏叶总黄酮提取物单独作用IC50为参考，将两种黄酮提取物按照复配比为1∶1、1∶3、1∶9、3∶1、9∶1进行混合，分析混合后的复合总黄酮提取物对DPPH自由基清除能力，计算复合组的IC50，试验结果见表1。

表1 金银花、银杏叶总黄酮复配混合物清除DPPH自由基能力Table1 DPPH radicalscavenging capacity of com bination

续表1金银花、银杏叶总黄酮复配混合物清除DPPH自由基能力Continue table1 DPPH radicalscavenging capacity of combination

由表1可知，随着金银花、银杏叶混合物总黄酮浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率逐渐增大。采用DPPH自由基清除试验比较银杏叶总黄酮与金银花总黄酮复配比例对协同抗氧化能力的影响，结果显示这两种黄酮提取物复配后存在协同作用，且按不同比例进行复配的协同抗氧化作用大小存在着一定差异。

为了比较直观的分析金银花、银杏叶总黄酮间协同作用，应用Isobologram分析得到两种物质复配后的效应图2。

由图2可知，金银花、银杏叶总黄酮复配组的效应点均落在相加线和95%可信线的下方，表明两者之间具有协同抗氧化作用。

图2 金银花、银杏叶总黄酮复配的Isobologram分析图Fig.2 Isobolographic plotof flavonoids from honeysucklewith ginkgo leaves

2.4统计学分析

采用t检验对IC50add和IC50mix进行统计比较，若IC50mix＜IC50add，表示金银花、银杏叶总黄酮之间具有协同作用。按照1.4进行分析，试验结果见表2。

表2 复合黄酮提取物IC50mix和IC50addTable2 The IC50mixand IC50addof Combination

表2结果显示各种组合的IC50mix均小于IC50add，经过t检验证明两者之间存在显著性差异，且具有较好的协同作用。相互作用指数γ值均小于1，表明金银花、银杏叶总黄酮间有协同作用，协同相互作用的大小顺序为1∶9＞1∶1＞1∶3＞3∶1＞9∶1。金银花总黄酮与银杏叶总黄酮复配比为1∶9时，γ值最小，协同清除DPPH自由基的相互作用最好。

3结论

采用DPPH自由基清除实验，比较金银花黄酮、银杏叶黄酮对DPPH自由基活性的清除率，并分析将二者按照一定的比例进行复配的抗氧化性。结果显示，金银花、银杏叶总黄酮复配后清除DPPH自由基的相互作用指数（γ）均小于1，二者复配可以增强清除DPPH自由基效果。金银花总黄酮与银杏叶总黄酮复配比为1∶9时，γ为0.71，协同清除DPPH自由基的相互作用效果最好。本试验基于这两种黄酮提取物进行的研究，存在一定的试验误差，两者复配的最佳配比还需要大量的研究数据，以优化复合配比的试验方案，以便于更好的指导生产实践。

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Synergistic Removing DPPH Radicals of Flavonoids from Honeysuck le and Ginkgo Leaves

SHIYan-bin
（TianshiCollege，Tianjin 301700，China）

Themethod of ultrasonic assisted extraction was used to extract flavonoids from honeysuckle and ginkgo leaves.The two kinds of flavonoids extraction wasmixed according to certain proportion.Then themixtureon vitroantioxidantactivity ofoxidation resistancewasanalysed by testing scavengingabilityofDPPH radical.The resultsshowed that the two kindsof flavonoids from honeysuckleand ginkgo leaveshad obvious removal effects on DPPH free radicals，and the half of clearance（IC50）were 58.14μg/mL and 61.32μg/mL.And Isobologram analysis demonstrated the response of factorof flavonoids from honeysuckle and ginkgo leaveswere both located in the leftof the addition line and 95%confidence interval.Therewasa significantdifference between experimental IC50mixand theoretical IC50add.The interaction index（γ）wereall less than 1，themixtureexhibited stronger removing capacity of DPPH radicals that the single one.When the proportion of honeysuckle flavonoidsand ginkgo flavonoids（allof the following compound ratio refered to themass ratio）was1∶9，γwas 0.71.The collaborative interaction effectof removing DPPH free radicalswas the best.

honeysuckle；ginkgo leaves；flavonoids；DPPH；synergistic antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.010

2016-11-17

石艳宾（1977—），女（汉），高级工程师，硕士研究生，研究方向：天然产物开发与质量管理。