牵拉损伤对大鼠坐骨神经影响的实验研究

童昌军，魏优秀，黄 康

·论 著·

牵拉损伤对大鼠坐骨神经影响的实验研究

童昌军，魏优秀，黄 康

目的 探讨大鼠坐骨神经牵拉伤后MRI变化以及损伤过程中转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的表达和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅰ、Ⅲ)含量的变化。方法 将50只成年雄性SD大鼠随机分为对照组(仅暴露坐骨神经)和牵拉组(大鼠右侧后腿坐骨神经牵拉伤)，分别于术后3d，2、4、6、8周，随机取两组大鼠各5只，切取牵拉段神经行MRI、组织形态学、免疫组织化学的观察及反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western Blot定量测定TGF-β1的表达和COL-Ⅰ、Ⅲ含量。结果 牵拉损伤后MRI表现为神经增粗，T1、T2时间延长；牵拉组大鼠坐骨神经TGF-β1的表达和COL-Ⅰ、Ⅲ含量明显高于对照组，两者差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 坐骨神经牵拉损伤后，周围神经发生纤维化病变，COL-Ⅰ、Ⅲ含量显著增加，TGF-β1表达有显著差异，提示TGF-β1在周围神经纤维化过程中具有一定的作用。

牵拉损伤； 坐骨神经； MRI； 转化生长因子； 胶原蛋白

周围神经损伤是临床常见损伤，以挤压、牵拉、撕裂性损伤多见，具有致残后遗症，不仅给患者身心造成重大伤害，也给患者的家庭和社会带来沉重负担，是目前亟待解决的一个难题。国内外学者对周围神经挤压伤后病理报道较多，但是对常见类型牵拉损伤的病理变化报道较少。本研究采用大鼠坐骨神经牵拉损伤模型，模拟人体周围神经慢性牵拉损伤病理过程，动态监测坐骨神经内转化生长因子β1(TGF-β1)表达的变化及 Ⅰ 、 Ⅲ 型胶原蛋白(COL-Ⅰ、Ⅲ)含量的变化，并对其相关性进行分析，探讨TGF-β1在周围神经慢性牵拉损伤过程中所起的作用，从而为慢性牵拉损伤致神经纤维化探索一条可行的治疗途径。

材料与方法

1 实验动物及分组

清洁级健康成年雄性SD大鼠50只(由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重(200±15)g。随机分成2组：A组(对照组)25只，B组(坐骨神经慢性牵拉损伤组)25只，常规分笼饲养，自由饮水进食。

2 动物模型的建立及取材

大鼠以戊巴比妥钠(40mg/kg)作腹腔注射麻醉，无菌条件下，左下肢背侧部纵向切口，钝性分离，游离坐骨神经。A组大鼠只暴露坐骨神经，B组大鼠暴露坐骨神经，用两把无齿输精管分离钳分别钳夹住坐骨神经主干，两把钳相距0.4cm，根据预实验结果，为尽量减少分离钳夹对神经的损伤作用，分离钳仅扣住一齿，均匀地用力向两侧分离两把分离钳，使两把分离钳夹持的神经牵拉到0.8cm，持续牵拉30s，此时可见神经被牵拉变细长，松开钳子，关闭伤口，常规方式饲养。

分别于术后3d，2、4、6、8周，随机选取A、B组大鼠各5只，麻醉下处死，备检。

3 MRI成像方法

使用Philips intera 1.5T超导型MRI扫描仪，采用直径11cm的环形表面线圈。大鼠麻醉成功后，取侧卧位，将待检查侧大鼠大腿紧贴表面线圈。分别对对照组、术后3d的大鼠进行坐骨神经MRI检查。检查序列包括：采用快速自旋回波TSE序列进行坐骨神经的T1W1、3D T2W1扫描，质子频谱预饱和反转恢复成像(3D T2W1/SPIR);使用Mixed多回波序列(多回波SE与多回波IR交叉序列)进行坐骨神经的T1时间测量，SE多回波序列进行T2时间测量。扫描层面方向为斜矢状位，与坐骨神经走行一致。具体参数T1W1：TR/TE650/20ms，层厚及层距2/1.0mm，矩阵256×512；3D T2W1：TR/TE 1 600/80ms；3D T2W1/SPIR：TR/TE 1 600/80ms；层厚及层距2/1.0mm，矩阵304×512；T1测量使用Mixed多回波TR(SE)：3 500ms，Tr(IR)：4 000ms，TE:20×8ms,tI:400,矩阵256×256；层厚：2.5mm。观察各个序列上牵拉伤后坐骨神经牵拉段、牵拉近段及牵拉远段形态及信号的变化。在Mixed及自旋多回波序列上，分别测量坐骨神经牵拉段、牵拉近段及牵拉远段牵拉前后的T1、T2值。

4 坐骨神经免疫组化分析

取术后2、4、6、8周大鼠坐骨神经牵拉段约1.0cm，常规石蜡切片脱蜡，水化；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤切片3～5次后滴加3%H2O2，室温静置10min；PBS冲洗2～3次后滴加正常山羊血清封闭液，室温静置10～15min；滴加兔抗TGF-β1或Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体(Abeam公司，英国)50μL，稀释倍数为1∶50，置于湿盒内，4℃过夜，滴加生物素化羊抗兔免疫球蛋白G(IgG),PBS洗后行3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水终止显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化脱水，透明、中性树胶封片后镜检。应用德国LEICA系统，在200倍视野下进行图像分析，用阳性反应细胞内的平均强度表示发生免疫反应阳性细胞内抗原物质量的多少。

5 聚合酶链式反应(PCR)技术检测TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA的表达

Trizol 溶液(GIBCO公司，美国)；TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ引物应用Primer 5.0引物设计软件[美国Invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司]设计；SYBR GreenⅠ荧光染料(Biotium公司，美国)。反应条件：94℃预变性3min、94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，共50个循环。应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值。

6 免疫印迹法(Western Blot)检测TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白的表达

β-actin(Sanata Cruz 公司，美国)；TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ一抗，兔抗鼠(Abeam公司，英国)；二抗均为羊抗兔(Abeam公司，英国)。以β-actin作为内参照，相对分子质量为42 000，浓度为1∶2500。取样本组织100mg匀浆后提取蛋白，经上样、转膜、封闭后，依次加入兔抗鼠多克隆抗体(1∶400)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体(1∶2400)、ECL显色剂充分显色。用美国Quantity One 4.4.0软件分析，得到吸光度(A)值数据并计算出TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白A值与β-actin蛋白A值的比值，间接反映TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ水平。

7 统计学分析

结 果

1 坐骨神经的MRI表现

坐骨神经牵拉伤后牵拉近段、牵拉段及牵拉远段比损伤前(对照组)的T2W1及T2W1/SPIR上神经信号增强，T1W1信号变化不明显，见图1、2。T1、T2值均延长(表1)。

表1 坐骨神经损伤前后T1、T2值比较

与损伤前比较：*P<0.05

2 坐骨神经牵拉伤后的病理变化

牵拉段表现为神经外膜充血、肿胀，大量淋巴细胞及少量红细胞浸润，神经纤维弥漫性变性、断裂(图3)，变成均质淡染无结构物质；电镜下表现为大部分神经纤维崩解呈碎片(图4)。牵拉近段表现为神经纤维明显肿胀，神经外膜充血，出现轻度的脱髓鞘改变，呈空泡状；电镜下表现为轴突变性及髓鞘崩解。牵拉远段光镜下表现为大量淋巴细胞浸润，神经纤维弥漫变性，神经外膜仍充血、肿胀；牵拉远段神经于损伤后部分轴突出现肿胀；电镜下表现为轴突溶解，髓鞘崩解。

3 牵拉伤后后肢功能的变化

B组坐骨神经牵拉伤后20只大鼠牵拉侧后肢均出现脱毛、溃疡肿胀、趾甲缺失、趾骨外露、踝下垂、展趾反射丧失、运动功能障碍。A组后肢活动自如，展趾反射功能正常，外观未见改变。

4 免疫组化染色观察及图像分析

A组大鼠神经细胞的胞质TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表达均呈阴性：B组TGF-β1的表达随时间而变化，术后4周时其表达量达到高峰，以后则逐渐下降，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ伤后表达持续性升高。计算机软件分析图片阳性染色强度，其吸光度(A)值越大，表示阳性染色物质越多，运用SPSS 13.0软件行A、B两组样本均数t检验，两组均数差异有统计学意义(P<0.05)，见图5～8。

5 不同时间TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA含量的表达变化

以A组坐骨神经TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达作为参考，B组TGF-β1mRNA表达明显升高，于术后4周达到高峰，最高可达A组4倍，以后逐渐下降。COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达也显著升高，于术后6周达到高峰，后处于平台期。两组数据差异有统计学意义(P<0.05)，见图9、10。

6 不同时间TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量(Western Blot)分析

神经组织中TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白均有不同程度的表达。与A组坐骨神经TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量相比，B组TGF-β1蛋白含量明显升高，于术后4周达到高峰，以后逐渐下降。COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量也显著升高，于术后6周达到高峰，后处于平台期。A、B两组均数差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 图2

图1 大鼠坐骨神经牵拉伤后3D T2W1图像：坐骨神经 牵拉段及牵拉远段肿胀,信号明显升高

图2 大鼠坐骨神经牵拉伤后3D T2W1/SPIR图像：坐骨 神经牵拉段及牵拉远段肿胀,信号升高更为明显

图3 图4

图3 大鼠坐骨神经牵拉段光镜下表现 神经纤维弥漫变性、断裂(HE ×200)

图4 坐骨神经牵拉段电镜表现 髓鞘崩解,轴突溶解 (×3000)

图5 图6

图5 A组TGF-β1免疫组化图像，染色呈阴性 ×200

图6 B组4周时见大量片状棕黄色TGF-β1阳性染色 ×200

图7 图8

图7 B组6周时大量条索状棕黄色阳性染色物质COL-Ⅰ ×200

图8 B组大量条索状、棕褐色阳性染色物质COL-Ⅲ ×200

图9 图10

图9 各实验组不同时间TGF-β1 mRNA表达相对值

图10 各实验组不同时间COL-I mRNA表达相对值

讨 论

周围神经损伤模型以挤压伤、切割伤报道较多，牵拉伤模型国内外报道较少。本研究模拟牵拉伤机制，对大鼠坐骨神经制作周围神经牵拉伤模型进行研究。Fullarton等[1]先用两把紧邻着的Dunhill钳钳夹神经造成挤压伤，再牵拉至5mm，然后持续性牵拉神经30s，使牵拉段神经最终长1.5cm，建立了山羊臂丛神经牵拉伤的模型，其主要对牵拉伤的神经修补时间及方法进行了研究。本研究借鉴其牵拉伤模型制作方法并进行改良，在预实验的基础上，成功建立了坐骨神经牵拉伤模型，病理显示造成周围神经Sunderland Ⅳ度损伤[2]。坐骨神经损伤后，大鼠损伤侧后肢出现脱毛、溃疡肿胀、趾骨外露，这些改变与神经损害后神经营养障碍、感觉神经功能障碍、感觉缺失后肢体反复的机械损伤、坐骨神经损伤后运动功能障碍导致机械性损伤机会增多等因素有关。

周翠屏等[3]报道兔坐骨神经急性牵拉伤后，T2W1信号增高，神经/肌肉信号强度比的动态变化能无创地反映神经损伤后病理学上逐渐修复的过程，可作为检测神经损伤退变和修复及评估预后的有效手段。Stanisz等[4]在神经切割伤和挤压伤后第1、2、3、4、6周测量了T1及T2值，发现神经损伤后，神经的脱髓鞘、炎症反应及轴突缺损引起T1、T2值升高。本研究中坐骨神经牵拉伤后，牵拉近段、牵拉段及牵拉远段神经的T2W1信号升高，T1、T2值显著延长；而病理组织学此时表现为坐骨神经牵拉伤后神经外膜充血、肿胀、炎症细胞浸润，牵拉段神经纤维弥漫性坏死、崩解，变成均质淡染无结构物质；电镜下表现为神经纤维弥漫崩解呈碎片。从MRI及病理组织学上说明大鼠坐骨神经牵拉伤模型制作成功。

已有实验研究证明，神经急性钳夹伤后，其TGF-β1表达明显升高，而TGF-β1是公认的促进细胞外基质(ECM)过度沉积、刺激胶原合成增加引起器官纤维化的重要因子，实验旨在研究神经慢性牵拉损伤后其ECM内胶原蛋白含量变化及TGF-β1在此过程中的表达规律及作用。与对照组相比，牵拉组TGF-β1、COL-Ⅰ、 COL-Ⅲ含量均明显升高；TGF-β1在牵拉后第4周达到高峰，后有逐渐下降趋势，但仍处于高表达状态；COL-Ⅰ、 COL-Ⅲ含量也持续升高，于牵拉后6周达到高峰，后处于平台期。TGF-β1的高表达与COL-Ⅰ、 COL-Ⅲ的升高在一定时期呈正相关，尤其在牵拉早期约4周内，二者含量同步升高。证明牵拉后TGF-β1升高为胶原蛋白高表达，促进神经纤维化的一个重要因素。

Cahbrese和Kitamura等[5-6]分别实验研究证实，肝纤维化组织中TGF-β1和Smad 4的表达明显升高，其mRNA高表达主要集中在肝Kupffer细胞内，促使肝纤维化形成。陈亮等[7]从细胞与分子学水平研究证明TGF-β1在细胞组织纤维化发生过程中的重要作用。有人通过有效干扰TGF-β1mRNA、Smad 4基因的转录，延缓实验动物肝病的进展，说明TGF-β1参与胶原纤维的形成、沉积和肝纤维化的发生。Chodon等[8]在病理性瘢痕中发现TGF-β1水平显著增高，TGF-β1的增加能显著抑制Fas介导的成纤维细胞凋亡，加速成纤维细胞的增殖和胶原合成速度。由此可见，TGF-β1的高表达是促进纤维化的重要因素，但纤维化发生机制及治疗措施有待研究探索。

[1] Fullarton AC,Lenihan DV,Myles LM,et al.Assessment of the method and timing of repair of a brachial plexus traction injury in an animal model for obstetric brachial plexus palsy[J].J Hand Surg(Br),2002,27(1):13-19.

[2] Robinson LR.Traumatic injury to peripheral nerves[J].Muscle Nerve,2000,23(6):863-873.

[3] 周翠屏,成丽娜,段小慧,等.兔坐骨神经急性牵拉伤模型的制作：MRI与病理对照[J].中国医学影像技术,2009,25(S1):5-7.

[4] Stanisz GJ,Midha R,Munro CA,et al.MR properties of rat sciatic nerve following trauma[J].Magn Reson Med,2001,45(3):415-420.

[5] Calabrese F，Valente M，Giacometti C，et al．Parenchyrnal transforming growth factor-beta 1：its type Ⅱ receptor and Smad signaling pathway correlate with inflammation and fibrosis in chronic liver disease of viral etiology[J].J Gastreenterol Hepatol，2003，18(11)：1302-1308．

[6] Kitamura Y，Ninomiga H．Smad expression of hepatic stellate cells in liver cirrhosis in vivo and hepatic stellate cell liver in vitro[J].Pathol Int，2003，53(1)：18-26．

[7] 陈亮，陈振兵，翁雨雄,等．Erk和p38信号转导通路对大鼠肌源性干细胞内结缔组织生长因子表达的调控作用[J].中华手外科杂志，2010,26(2)：110-112．

[8] Chodon T,Sugihara T,Igawa HH,et al.Keloid-derived fibroblasts are refractory to Fas-mediated apoptosis and neutralization of autocrine transforming growth factor-beta 1 can abrogate this resistance[J].Am J Pathol,2000,157(5):1661-1669.

(本文编辑： 黄小英)

Experimental research of effects of traction injury on the rat sciatic nerve

TONGChang-jun,WEIYou-xiu,HUANGKang

(Department of Orthopedics,Liyuan Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430077,China)

Objective To investigate the change of MRI, transforming growth factor β1(TGF-β1) and collagen type Ⅰ,Ⅲ(COL-Ⅰ,Ⅲ) after sciatic nerve traction injury. Methods Fifty adult male SD rats were randomly divided into group A and B. In group A(the control group)the sciatic nerve of rats was exposed only. In group B(the traction injury group) the sciatic nerve of rats was tracted by smooth forceps to produce traction injury. Electron microscopy, immunochemistry,RT-PCR and Western Blot were performed to observe the morphological changes of the tracted nerve tissue and to determine the level of TGF-β1,COL-Ⅰand COL-Ⅲ at 3 days and 2,4,6,8 weeks after the surgery,respectively. Results The injured nerve was characterized as thickened in size and increased T1 and T2 relaxation time. The expression of TGF-β1 in the traction injury group was significantly higher than that of the control group(P<0.05). In the meanwhile,the contents of COL-Ⅰ,COL-Ⅲ were positively correlated in a certain period(P<0.05). Conclusion Peripheral nerve fibrosis can be caused by nerve traction injury which induces increased expression of COL-Ⅰ，COL-Ⅲ in the nerve. TGF-β1 is significantly higher than that of the control group,which suggests that TGF-β1 plays an important role in the process of neural injury and fibrosis.

traction injury; sciatic nerves; MRI; transforming growth factor; collagen

1009-4237(2017)01-0035-04

华中科技大学自主创新研究基金资助项目(2013QN126)

430077 武汉，华中科技大学同济医学院附属梨园医院骨科

魏优秀，E-mail:2713910700@qq.com

R 651.3

A 【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2017.01.009

2016-01-21；

2016-05-20)