嗜肺军团菌分子检测最新进展

林韵，肖晓臻，肖贤声，陆勇军

1.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275；2.广州市金润环保科技有限公司，广东 广州 510726

嗜肺军团菌分子检测最新进展

林韵1，肖晓臻2，肖贤声2，陆勇军1

1.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275；2.广州市金润环保科技有限公司，广东 广州 510726

嗜肺军团菌是军团病最主要的致病原，在人工水体或空调冷却系统中多有存在，是影响公众健康的一大隐患。能否准确高效地检测嗜肺军团菌，对军团病的防控具有重要意义。分子生物学技术多具有快速、简便、特异、灵敏等优点，近年越来越多地应用于嗜肺军团菌的检测。本文简要综述了嗜肺军团菌分子检测的最新进展，介绍了PCR及其衍生技术、核酸等温扩增技术、基因分型、探针杂交及其相关技术，以及新一代测序在嗜肺军团菌分子检测中的应用，并简单讨论了嗜肺军团菌检测存在的问题，对嗜肺军团菌分子检测的前景进行了展望。

嗜肺军团菌；分子检测；核酸技术

军团菌属细菌（Legionellasp.）是一类革兰阴性菌，广泛存在于天然淡水或人工水体中。该属的许多种类一旦以气溶胶的方式被易感人群吸入肺中，即有可能在肺泡中繁殖，并导致军团病（legionellosis或 Legionnaires'disease，LD）。军团病可分为庞蒂亚克热（Pontiac fever）和军团菌肺炎（Legionnaires pneumonia），前者是一种自限性流感样疾病，后者按严重程度从轻微咳嗽到快速致命的肺炎不等[1]。

嗜肺军团菌（L.pneumophila）是军团病最主要的致病原。1976年，美国费城召开的退伍军人大会上暴发了一场大规模感染，221人出现非典型肺炎症状，34人死亡；次年分离出致病菌株，即嗜肺军团菌[2-3]。此后，军团菌病在世界各地时有暴发流行，我国也于1982年首次报道了军团菌病的临床病例[4]。研究表明，军团菌肺炎暴发的首要风险来自中央空调冷却塔和供水系统[1]。我国卫生部于2012年发布的《公共场所集中空调通风系统卫生规范》中明确指出，集中空调系统冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌[5]。随着我国城市化水平的提高，空调及供水系统普及，嗜肺军团菌的检测对预防军团菌病的暴发和流行无疑具有重要意义。

自军团菌病于1977被报道以来，环境中嗜肺军团菌的检测就受到极大的重视，各种检测方法也不断出现。传统的嗜肺军团菌检测方法有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测等。细菌培养法是检测嗜肺军团菌的“金标准”，但其生长所需营养丰富，耗时长，检测成本高且效率低下；血清学检测则存在滞后性，缺乏早期诊断意义；尿抗原检测对血清型1型（LP1）以外的嗜肺军团菌敏感性较低[6]。近年发展的分子生物学技术以其快速、简便、特异、敏感等优点，已在嗜肺军团菌检测及军团病快速诊断方面占有一席之地。

分子生物学针对生物大分子，如DNA、RNA、蛋白质等进行研究。应用蛋白质技术对病原微生物进行检测多与抗体相关，一般归类于免疫学方法，在此不做赘述。随着基因组学研究和高通量测序等技术的不断进步，嗜肺军团菌的核酸分子生物学检测技术也得到了长足发展。现就分子生物学核酸技术在嗜肺军团菌检测中应用的最新进展做一概述。

1 聚合酶链式反应及其衍生技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种由DNA聚合酶催化的特定序列体外扩增技术。对嗜肺军团菌来说，常用的检测靶标为mip（macrophage infectivity potentiator，巨噬细胞感染力增强因子）基因和16S rRNA基因。前者为嗜肺军团菌所特有，后者可用于分辨军团菌属。Yong等认为，随着科学家对军团菌基因组研究的加深，将会出现更多新的分子靶标，使嗜肺军团菌的检测更为精确[7]。

PCR作为一种常规、可靠的核酸扩增技术，常与其他分子生物学技术手段结合使用，如基因分型（genotyping）、探针杂交（probe hybridization）等。PCR也发展出了一系列衍生技术，下面简述2类应用较多的技术。

1.1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR是除了细菌培养法外惟一一项写入ISO技术规范的军团菌属和/或嗜肺军团菌检测标准[8]。Omiccioli等以34株军团菌和16株非军团菌为材料进行检测，对这一方法进行了确认；并认为在军团菌检测中，qPCR能够取代培养法而不仅仅是作为替代选项[9]。

1.2 多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）是指用多对引物同时扩增不同的DNA序列，可同时检测出多种病原微生物。Calvo等运用多重PCR从阿米巴体内同时检测包括嗜肺军团菌在内的5种病原菌[10]；Cao等以O抗原基因为靶标，运用多重PCR成功分辨出嗜肺军团菌的6种血清型[11]。

2 核酸等温扩增

核酸等温扩增（isothermal nucleic acid ampli⁃fication）技术能在某一特定温度下扩增核酸，因而摆脱了对热循环仪的依赖，具备临床或现场快速检测及基层推广的潜力。核酸等温扩增技术的种类很多，如以RNA为模板的依赖于核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、模拟DNA自然复制过程的依赖解旋酶的等温扩增（helicase-dependent amplification，HDA）、模拟微生物环状DNA复制过程的滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）、利用具有链置换活性的DNA聚合酶的环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、利用限制性内切酶的链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）等[12]。

核酸等温扩增已被运用到嗜肺军团菌的检测中。Lu等运用LAMP法快速检测出嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌[13]；笔者也成功地以IVB型分泌系统的基因为靶标，用LAMP法检测了嗜肺军团菌（论文待发表）。市面上已存在专门的军团菌等温扩增检测试剂盒，如日本荣研化学株式会社的“朗报（LAMP）”军团菌核酸检测试剂盒；国内也有生物公司，如广州华峰生物科技有限公司、广州迪澳生物科技有限公司等开发出类似产品。

3 基因分型

基因分型是指将待测个体的DNA序列经生物学方法处理后，再与已知个体的基因型进行对比分析的技术。基因分型常用于微生物领域，尤其是病原微生物的监测。传统的基因分型技术有随机扩增多态性DNA（random amplified poly⁃morphic DNA，RAPD）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等，须通过观察电泳图谱判定结果，存在一定的主观性。目前嗜肺军团菌基因分型的“金标准”是基于测序的分型法（se⁃quence-based typing，SBT）[14]，可直接做序列对比，避免了这一缺陷。Bianchi等运用SBT分析了2003～2012年29个临床和环境样本分离得到的嗜肺军团菌，找到了样本间的联系，证明对环境株的定期采样分析对军团病暴发流行的防控有重要作用[15]。

4 探针杂交及其相关技术

4.1 探针杂交

杂交探针（hybridization probe）是一小段带有可检测标记的核酸片段，可检测样品中是否存在与之互补的靶序列。核酸分子探针易于合成和修饰，且具有较高的灵敏度和选择性[16]，因此被广泛用于病原微生物的检测。Siegrist等运用夹心杂交法（sandwich hybridization），用2种不同标记的探针检测军团菌的rRNA，39份军团菌阳性水样的分析结果与ISO 11731（GVPC和BCYE琼脂培养基培养）的测定结果无显著差异[17]。

4.2 DNA微阵列

将大量核酸探针按一定顺序以点状固定在固体支持物（玻片或尼龙膜）上，即为DNA微阵列（DNA microarray），也叫DNA芯片、基因芯片或生物芯片。这一方法快速、简便、精准、经济，商业化潜力大[18]，目前已见于军团菌的检测中。Z·ak等运用小型DNA微阵列识别出嗜肺军团菌66个毒力基因，并用于环境株的分析[19]。

4.3 生物传感器

生物传感器（biosensor）是一种由生物敏感材料制成的识别元件（如探针）和物理化学检测器组成的检测装置。这一系统特异、灵敏，可信度高，可实时监测，操作简便[20]，广泛应用于环境、食品、医疗等领域。Rai等用以纳米多孔氧化铝薄膜为基础的无标记电化学DNA生物传感器检测出最低检测限（LOD）为3.1×10-13mol/L的嗜肺军团菌，且能从中分辨出1个及3个碱基错配[21]。

5 新一代测序

新一代测序（next generation sequencing，NGS），也叫高通量测序（high-throughput sequenc⁃ing，HTS），能一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，大大减少了测序所需的时间和费用，使得将测序用于流行病实时监控分析成为可能。在2013年澳大利亚一所大型医院暴发的军团病中，SBT与毒力基因分析均无法分辨出致病菌株。Graham等运用全基因组测序，从9株嗜肺军团菌血清型1型菌株中成功地找到了致病菌株，并发现了它与2011年同一所医院的一个军团病病例的联系[22]。除此之外，测序提供了大量高质量的生物信息学数据，使嗜肺军团菌的研究更为细致与深入。

6 结语

分子生物学检测技术适用性强，易于推广，目前已应用到多种病原微生物检测中[23]。分子检测多具有简便、快速、经济等优点，在实时监控和及时预警上具有很大的优势。因此，嗜肺军团菌分子检测的发展与应用对军团病的防控具有重要意义。

分子检测多以样品中的DNA为靶标，亦即无论样品中的嗜肺军团菌是否存活均可得到阳性结果，使得分子检测与培养法相比可能存在假阳性。当然，已有研究表明，DNA提取前用氮溴化乙锭（ethidium monoazide，EMA）和叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）进行预处理后，可以只扩增活细胞的基因[24]。

值得一提的是，冷却塔水、自来水等人工水体属寡营养环境，且多处于低温状态或含有消毒剂，在此环境下嗜肺军团菌会进入“活的不可培养状态（viable but non culturable state，VBNC状态）”而无法在常规培养基上培养检出。目前并没有VBNC状态的军团菌能在人类细胞或哺乳动物模型中复苏的案例，然而也没有研究表明能完全排除VBNC状态的军团菌致病的可能性[25]。军团菌检测的复杂性使我们认识到，分子检测法并不能完全取代传统的检测手段；根据需要选择相应的检测方法，或几种检测手段组合使用，才能获得最佳效果。

分子生物学是一门发展迅速的学科。我们有理由相信，现有的嗜肺军团菌分子生物学检测手段将会不断完善；同时，也会有更多新的、优秀的技术涌现，使包括军团菌在内的病原微生物的检测更加准确、特异与灵敏。

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Recent Progress of Molecular Methods forLegionella pneu⁃mophilaDetection

LIN Yun1,XIAO Xiao-Zhen2,XIAO Xian-Sheng2,LU Yong-Jun1*
1.School of Life Sciences,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510275;2.Guangzhou Jinrun Environmental Protection Company,Guangzhou 510726;China

Legionella pneumophila,the major pathogen of legionellosis,widely exists in man-made water or cool⁃ing systems and remains a great public health concern.Prevention and control of legionellosis requires accurate and efficient detection ofL.pneumophila.Generally,molecular biological techniques are rapid,simple,specific and sensitive,therefore increasingly applied toL.pneumophiladetection.This review briefly introduced the recent prog⁃ress of molecular methods forL.pneumophiladetection,including PCR and its derived techniques,isothermal nucle⁃ic acid amplification techniques,genotyping,probe hybridization and its related techniques as well as next genera⁃tion sequencing.Finally,existing problems and perspective of molecular methods forL.pneumophilawere discussed.

Legionella pneumophila;molecular detection;nucleic acid techniques

Q78;R378

A

1009-0002（2017）05-0704-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:luyj@mail.sysu.edu.cn

2017-03-08

广东省科技协同创新与平台环境建设项目（2014B090901019）

林韵（1994- ），女，博士研究生，（E-mail）498281230@qq.com通信作者：陆勇军，（E-mail）luyj@mail.sysu.edu.cn