CD19蛋白截短体慢病毒表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

2017-10-24张峥嵘王嫚娜梁剑青李世崇黄红艳闫敏陈昭烈刘真真孙强

生物技术通讯 2017年5期

张峥嵘，王嫚娜，梁剑青，李世崇，黄红艳，闫敏，陈昭烈，刘真真，孙强

1.郑州大学附属肿瘤医院乳腺科，河南郑州 450008；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071；3.首都医科大学附属北京世纪坛医院肿瘤内科，肿瘤治疗性疫苗北京市重点实验室，北京 100038

张峥嵘1，2，王嫚娜2，梁剑青2，李世崇2，黄红艳3，闫敏1，陈昭烈2，刘真真1，孙强2

目的：构建胞内段缺失的CD19蛋白截短体（CD19t）慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro，并建立稳定表达CD19t的人红白血病细胞系K562/CD19t。方法：合成CD19t基因全长，酶切产物插入慢病毒载体pLVXEF1α-IRES-Puro，将重组质粒转染293FT细胞包装病毒后感染人红白血病细胞系K562，采用Western印迹和免疫荧光技术检测CD19t在K562细胞中的表达，并通过ELISA检测K562/CD19t与CD19 CAR-Jurkat共培养上清中的IL-2浓度。结果：酶切鉴定与测序结果表明成功构建慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro；Western印迹和免疫荧光检测到K562/CD19t细胞中CD19t的表达；ELISA结果显示表达的CD19t能够刺激识别CD19的CAR-Jurkat细胞分泌IL-2。结论：构建了CD19蛋白截短体慢病毒表达载体，并在K562细胞中表达,有助于进一步构建B细胞白血病动物模型和验证CAR-T效能。

CD19；基因克隆；B细胞；CAR-T免疫疗法

CD19分子，又名Leu-12或B4，最早于1983年被Naderl等发现[1]。CD19基因位于第16条染色体短臂16p11.2，由15个外显子组成，编码556个氨基酸残基[2]。CD19表达于正常成熟B细胞、恶性B细胞和B前体细胞，在成熟B细胞中的表达量约是未成熟B细胞中的3倍[3-4]。CD19分子属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，只有一个跨膜区，胞内段是C端，胞外段是N端[5]。胞外区包括2个C2型免疫球蛋白样的结构域和1个N端糖基化位点，C2球蛋白结构域间由硫键相连。多个实验证明，其胞内区域是高度保守的，并且包含3个具有重要功能的酪氨酸残基Y391、Y482和Y513[4,6]。

CD19参与了B细胞的活化、发育过程，其结构基础是CD21-CD19-CD81复合物，该复合物降低了B细胞固有或受体依赖的信号阈值，同时还能不依赖B细胞受体的存在，与C3d结合影响B细胞受体信号途径[7-9]。近年来，CD19分子作为B细胞的标记分子的作用越来越受到重视：一方面，CD19可以作为白血病免疫细胞分型依据[10]；另一方面，在B细胞恶性肿瘤治疗领域，CD19能够作为一个重要的治疗靶点，尤其是靶向CD19分子的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞疗法在近年的临床实验中获得了很大的成功[11]。

考虑到CD19全长会降低慢病毒对淋巴细胞的感染效率，我们拟构建截短的CD19蛋白（CD19t）慢病毒表达载体并感染K562细胞，通过ELISA确定其对识别CD19的CAR-Jurkat的刺激作用，为进一步研究CD19分子在B细胞恶性肿瘤中的作用和验证CAR-T的效能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

Jurkat细胞购自北京协和细胞资源中心（采用Hyclones公司的RPMI1640培养基培养）；293FT细胞、K562细胞为本实验室保存（293FT细胞采用Omacgene公司的DMEM培养基培养，K562细胞采用Hyclones公司的RPMI1640培养基培养）；大肠杆菌Trans10购自北京全式金生物技术有限公司；质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro购自优宝生物公司；CD19截短体对应的核苷酸序列由金斯瑞公司合成，以pUC57的质粒形式提供；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根公司；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ购自NEB公司；LipofectAMINE LTX&Plus Reagent、嘌呤霉素、抗CD19-N端抗体、抗GAPDH抗体和二抗均购自Invitrogen 公司；Human IL-2 ELISA kitⅡ购自 BD公司。

1.2 CD19截短体慢病毒表达载体的构建

设计的CD19t不包含胞内段编码基因，全长1029 bp。前后分别是EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点，中间由66 bp的信号肽序列、27 bp的HA标签、915 bp的胞外段与跨膜区对应序列和终止密码子组成（图1）。由金斯瑞公司合成，以pUC57质粒形式提供。用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切得到目的片段，胶回收后连入pLVX-EF1α-IRES-Puro载体的EcoRⅠ/BamHⅠ位点，构建得到pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表达载体（图2）。

图1 CD19蛋白截短体CD19t序列设计示意图

1.3 病毒包装、感染

293FT细胞按1×106/孔接种于 6孔板，37℃、5%CO2条件下培养，次日将目的慢病毒载体与包装质粒D8.9、VSVG-L用脂质体LipofectAMINE LTX&Plus Reagent共转染293FT细胞，6 h后换液，于24、48、72 h收取上清，用4.5 μm滤器过滤，将K562细胞按1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1 mL RPMI1640培养基、1 mL病毒上清和1.5 μL聚凝胺，3 d后用嘌呤霉素（0.5 μg/mL）筛选4～5 d，获得目的细胞株K562/CD19t。

图2 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表达载体构建示意图

1.4 Western印迹检测细胞CD19t蛋白的表达

取1×105K562/CD19t细胞，1000 r/min离心3 min，PBS洗2次，弃去PBS，于冰上加RIPA，冰上孵育振荡，30 min后12 000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清分装备用。取上清2.5 μL，蛋白定量得其浓度。配胶，加样，电泳（电泳分离胶浓度为15%，浓缩胶和分离胶分别用100 V/20 min、160 V/1 h）；转膜时设定100 V，1 h，并用5%的牛血清白蛋白（BSA）封闭；孵育蛋白一抗，4℃翻转过夜，TBST洗3次；孵育蛋白二抗，1 h，TBST洗3次；与发光液和稳定剂避光孵育2 min，于暗室中显影、定影。

1.5 免疫荧光检测细胞CD19t蛋白的表达

取5×104目的细胞，400 r/min离心 5 min，甩片后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，10 min/次；5%BSA室温封闭1 h，弃去封闭液，加入抗CD19-N端抗体（1∶50稀释），4℃过夜；PBS洗3次，10 min/次，加入荧光标记二抗（1∶200稀释），室温孵育 40 min，PBS洗 3次，10 min/次；用含DAPI的封片剂封片保存，荧光显微镜观察。

1.6 检测K562/CD19t与嵌合抗原受体Jurkat细胞共培养上清中IL-2的表达

取2×104K562/CD19t细胞和 1×104识别 CD19的CAR-Jurkat细胞，于48孔板中共培养过夜，12 h后取上清，1500 r/min离心3 min，弃沉淀，上清分装备用。用BD公司的Human IL-2 ELISA KitⅡ试剂盒检测上清中IL-2的浓度。

2 结果

2.1 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表达载体的构建

将含有CD19t基因的质粒pUC57-CD19t用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，目的片段连入经相同酶切的pLVX-EF1α-IRES-Puro载体，随机选取2个克隆，分别用EcoRⅠ/BamHⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定，DNA电泳片段和模式与预期相符（图3），序列测定显示插入序列正确无误（结果未示），证明pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表达载体构建成功。

图3 质粒pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro的双酶切产物电泳图谱

2.2 Western印迹检测转染后K562细胞中CD19t的表达

以转染空载体的K562为对照组，转染pLVXEF1α-CD19t-IRES-Puro载体的 K562/CD19t为实验组，并以GAPDH为内参。结果显示，实验组表达CD19t而对照组，差异明显（图4）。

2.3 免疫荧光检测转染后K562细胞中CD19t的表达

CD19t具有跨膜区，理论上会表达于细胞膜表面。因此，我们检测了CD19t在目的细胞K562/CD19t中的表达定位。如图5所示，CD19t（绿色）高度表达于K562/CD19t的细胞膜处，而转染空载体的K562/NC则不表达。

图4 Western印迹检测CD19t蛋白在K562细胞中的表达

图5 CD19t蛋白表达于K562细胞膜上（荧光显微镜，×400）

2.4 ELISA检测K562/CD19t和CAR-Jurkat共培养上清中IL-2的表达量

根据设计，截短体CD19t的胞外区会发挥与CD19胞外区类似的功能。将转染CD19t和转染空载体的K562细胞分别与识别CD19的CAR-Jur⁃kat共培养，取上清检测IL-2浓度。如图6所示，实验组与对照组的细胞因子IL-2浓度差异显著，提示K562/CD19t表达的CD19t能够被识别CD19的CAR-Jurkat有效识别，并能刺激CAR-Jurkat细胞分泌IL-2。

图6 ELISA检测K562/CD19t和CAR-Jurkat细胞共培养上清中IL-2的浓度

3 讨论

CD19分子主要表达于B细胞表面，调节B细胞相关信号的转导，在临床诊断和治疗方面也具有重要意义。几乎所有B细胞来源的恶性肿瘤细胞均表达CD19，因此以CD19为靶标的免疫治疗方法具有相当程度的治疗效果。

这些免疫治疗方法主要有两类：一类是抗CD19分子的单克隆抗体的应用，一类是嵌合抗原受体CART-CD19细胞疗法。前者主要有非结合抗体、药物共轭抗体和双特异性抗体。其中，一种针对急性淋巴白血病的双特异性抗体药物Blinatumomab在36例患者的研究中，除2人外均达到了缓解。后者，CART-CD19细胞疗法是迄今细胞治疗肿瘤领域效果最显著的方法，与“免疫检测点抗体阻断疗法”一起被Science杂志评为“2013年十大科学突破之首”[12]。

我们所构建的CD19截短体仅表达CD19分子的胞外区和跨膜区，为研究某些功能区域提供了如下便利：①CD19t基因的长度约为CD19全长的一半，能够提高表达目的基因的慢病毒载体对淋巴细胞的感染效率；②截短体不表达CD19分子的胞内区，可以与表达CD19分子全长或CD19胞内区截短体的细胞系相互比较验证，研究其胞外区对细胞功能的影响；③将来用截短体K562/CD19t细胞系所构建的小鼠移植瘤模型，既具有CD19抗原性，又避免了CD19分子本身对K562细胞的影响，并且可以为验证新型结构CART-CD19或靶向CD19的抗体药物的效能做好准备。

[1]Anderson K C,Park E K,Bates M P,et al.Antigens on human plasma cells identified by monoclonal anti⁃bodies[J].J Immunol,1983,130(3):1132-1138.

[2]Zhou L J,Ord D C,Omori S A,et al.Structure of the genes encoding the CD19 antigen of human and mouse B lymphocytes[J].Immunogenetics,1992,35(2):102-111.

[3]Haas K M,Tedder T F.Role of the CD19 and CD21/35 receptor complex in innate immunity,host defense and autoimmunity[J].Adv Exp Med Biol,2005,560:125.

[4]Carter R H,Wang Y,Brooks S.Role of CD19 signal transduction in B cell biology[J].Immunol Res,2002,26(1):45-54.

[5]Carter R H,Barrington R A.Signaling by the CD19/CD21 complex on B cells[J].Curr Dir Autoimmun,2004,7:4-32.

[6]Nagro C J D,Otero D C,Anzelon A N,et al.CD 19 function in central and peripheral B-cell develop⁃ment[J].Immunol Res,2005,31(2):119-131.

[7]Fujimoto M,Poe J C,Inaoki M,et al.CD19 regu⁃lates B lymphocyte responses to transmembrane signals[J].Semin Immunol,1998,10(4):267-277.

[8]Poe J C,Minardcolin V,Kountikov E I,et al.A c-Mycand surfaceCD19 signalingamplification loop promotes B cell lymphoma development and progres⁃sion in mice[J].J Immunol,2012,189(5):2318-2325.

[9]Deaglio S,Vaisitti T,Billington R,et al.CD38/CD19:a lipid raft-dependent signaling complex in human B cells[J].Blood,2007,109(12):5390.

[10]师越,王冬梅,廖晓龙.CD19分子的研究进展及临床应用[J].国际免疫学杂志,2015,38(2):156-160.

[11]James N.Kochenderfer Z Y,Frasheri D,et al.Adop⁃tive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells[J].Blood,2010,116(19):3875-3886.

[12]贾鹤晋,韩为东.抗CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞在血液系统恶性肿瘤中的应用[J].中华血液学杂志,2016,37(2):164-168.

Construction of Lentiviral Expression Vector for CD19 Truncated Protein and its Expression in K562 Cells

ZHANG Zheng-Rong1,2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Bioengi⁃neering,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

Objective:To construct the lentiviral expression vector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro for truncated CD19（CD19t） in cytoplasmic region,and examine its expression in K562 cells.Methods:CD19tgene was synthe⁃sized and cloned into pLVX-EF1α-IRES-Puro vector followed by virus packaging in 293FT cells.Human erythro⁃leukemia K562 cells were infected with recombinant lentivirus containing CD19t to construct K562/CD19t cells.The expression of CD19t was examined by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA was used to ana⁃lyze the secreted IL-2 in co-culture supernatant of K562/CD19t with CAR-Jurkat.Results:Lentiviral expressionvector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro was confirmed by double enzymatic digestion and sequencing.The expres⁃sion of CD19t in K562 cells was detected by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA showed that CAR-Jurkat secreted IL-2,which was stimulated by CD19t expression.Conclusion:The lentiviral vector for CD19t expression has been constructed and CD19t expression can be detected in K562/CD19t cells,which would be helpful to make animal model for B cell leukemia and test CAR-T performance.

CD19;gene cloning;B cells;CAR-T immunotherapy

Q78

1009-0002（2017）05-0634-05

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

2017-03-01

国家自然科学基金（81572799，31671432）；国家重点研发计划（2016YFC1303303）；北京市自然科学基金（7162091）

张峥嵘（1991- ），男，硕士研究生，（E-mail）18703605958@163.com；王嫚娜（1991- ），女，博士研究生；同为第一作者

刘真真，（E-mail）Liuzhenzhen73@163.com；孙强，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn