茯砖茶中咖啡碱与EGCG的HPLC检测分析

秦俊哲， 刘凯利， 黄亚亚, 王亚丽, 胡 歆， 邓永亮， 刘文军

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.陕西苍山茶叶有限责任公司， 陕西 咸阳 710003)

茯砖茶中咖啡碱与EGCG的HPLC检测分析

秦俊哲1， 刘凯利1， 黄亚亚2, 王亚丽1, 胡 歆2， 邓永亮2， 刘文军2

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.陕西苍山茶叶有限责任公司， 陕西 咸阳 710003)

利用高效液相等度洗脱法研究人工接种条件下茯砖茶中咖啡碱和EGCG的检测条件及含量.结果表明，HPLC的检测条件为：流动相A 甲醇，B 5×10-5mol/L KH2PO4溶液 (pH=5)，A∶B =20∶80，咖啡碱和EGCG 的进样量在25～400μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系，r>0.999 0，咖啡碱和EGCG的平均加标回收率及RSD分别为98.32%、97.18%、1.96%、1.73%，该方法分离效果好，重复性高，可用于同时测定茯砖茶中咖啡碱与EGCG的含量.在此基础上，第一、二次汽蒸后接种及CK成品茶的咖啡碱含量分别为23.63 mg/g、20.08 mg/g、24.37 mg/g，其EGCG的含量分别为6.43 mg/g、3.79 mg/g、8.31 mg/g，第二次汽蒸后接种最适宜.

茯砖茶； 高效液相色谱法； 咖啡碱； EGCG

0 引言

茯砖茶是最具特色的黑茶系类产品，加工工艺长而复杂，属后发酵茶[1]，含有多种功效成分，其中最主要的成分有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、咖啡碱及茶氨酸等[2].现阶段对于咖啡碱及EGCG的检测方法有高效液相色谱法、薄层扫描法、近红外光谱法及紫外分光光度法等[3-6]，其中高效液相色谱法稳定可靠，简便快速，应用最广泛.

目前，多数进行EGCG、咖啡碱单个成分的高效液相检测，在实践中费时费工，能否同时检测茯砖茶中的咖啡碱和EGCG尚未报道，因此本文采用HPLC法对人工接种发花过程中的咖啡碱与EGCG含量进行检测，并选择茯砖茶的两个不同生产工段进行人工接种，优化发花工艺，探明人工接种的最佳时机，一方面为茯砖茶中咖啡碱和EGCG的检测提供借鉴，另一方面为茯砖茶人工接种发花生产提供一些理论依据.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

(1)主要材料：咖啡碱(CAF)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、L-茶氨酸为标品，北京坛墨质检科技有限公司；甲醇(色谱纯)，酒石酸钾钠、蒽酮、浓硫酸、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司.

(2)主要仪器：P1201型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ5200型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；SP-756PC型紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；LS-C50L型立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备厂.

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计与方法

图1是茯砖茶加工工艺及实验设计流程，取拼配料30 kg，分成75份.如图1所示，在第一次汽蒸后和第二次汽蒸后各接种冠突散囊菌纯菌种发酵剂25块，其余为对照，压制后送入发花室.从第2 d开始，每2 d取样一次，每次取样各取2块，分别对样品中的茶多酚、EGCG及咖啡碱含量进行检测.

发酵剂制备：将长满斜面的冠突散囊菌菌落制成菌悬液，然后接种于麸皮培养基上，28 ℃培养8 d后，45 ℃烘干，粉碎过筛，即得冠突散囊菌纯菌种发酵剂.

图1 茯砖茶加工工艺及实验设计流程

1.2.2 检测方法

咖啡碱与EGCG采用高效液相色谱法[7]；

茶多酚总量采用GB/T8313-2002(酒石酸亚铁比色法)[8].

1.2.3 色谱条件

P1201型高效液相色谱仪,色谱柱Sino Chrom ODS-BP (C18，250 mm×4.6 mm，5.0μm)；流动相：甲醇(A)-5×10-5mol/L KH2PO4溶液(B,磷酸调pH为5)(20∶80)；柱温30 ℃，流速1.0 mL/min；检测波长210 nm，进样20μL.

1.2.4 标准溶液配制及标准曲线

准确称取2种标准品，纯水溶解，配置浓度400μg/mL的标准品溶液，逐级稀释，标准系列为400、200、100、50、25μL.按1.2.3色谱条件分别进样各质量浓度的标准溶液，进行测定，各做3次平行，得出标准曲线图谱、回归方程及r值.

1.2.5 样品处理

茶叶样品粉碎过80μm(80目)筛，准确称取0.25 g茶叶，加入70%乙醇12.5 mL，超声浸提45 min，待其冷却后离心10 min，转速5 000 r/min，取上清液；在茶叶残渣中加入70%乙醇12.5 mL,再超声提取45 min，相同转速下离心，取上清液，合并两次上清液，混匀.将上清液经0.45μm滤膜过滤两次，滤液用纯水定容至50 mL，摇匀，即得供试液.

1.2.6 加标回收实验

在已知含量的茶样浸取液中添加一定浓度的标准品溶液，做加标回收试验，检验该方法的准确度.准确量取一定量的咖啡碱和EGCG茶样提取液2份，分别添加一定体积的125μg/mL的咖啡因和EGCG的混合标准溶液，混匀，按1.2.3色谱条件平行测定3次，计算回收率.

1.2.7 精密度

取50μg/mL 的咖啡碱与EGCG标准品溶液分别连续进样6次，测定咖啡碱与EGCG标准品峰面积的RSD值.

1.2.8 样品测定

分别精密吸取1.2.5中得到的供试液20μL，按1.2.3色谱条件进样，测定其峰面积，在此条件下，咖啡碱与EGCG可以很好地被分离，色谱图如图2所示.

2 结果与讨论

2.1 线性关系

咖啡因和EGCG在25～400μg/mL范围内线性关系良好，如表1所示.

表1 2种标准品的回归方程及相关系数

2.2 色谱图

在1.2.3色谱条件下，得到咖啡碱与EGCG两种标准品的保留时间，分别为咖啡碱32.1 min， EGCG 51.7min，如图2(a)、(b)、(c)所示.茶样提取液进样后得到的谱图如图2(d)所示.

(a)咖啡碱标准品对照谱图

(b)EGCG标准品对照谱图

(c)咖啡碱和EGCG混标谱图

(d)茯砖茶样品谱图图2 高效液相色谱图

2.3 回收率

咖啡碱与EGCG平均加标回收率分别为98.32%和97.18%，结果较理想.

2.4 精密度

咖啡碱与EGCG标准品峰面积的RSD值分别为1.96%和1.73%，结果表明系统的精密度良好.

2.5 茯砖茶加工过程中咖啡碱含量结果分析

由图3可知，发花前中期(2 d～8 d)，咖啡碱含量变化不明显，发花第12 d之后，三种不同工艺茶砖的咖啡碱含量逐渐下降，其中第二次汽蒸后接种茶砖的咖啡碱含量下降速度最快，原因是第二次汽蒸后接种茶砖的发花效果最好，即冠突散囊菌的数量最多，有利于咖啡碱的转化.发花前中期(8 d之前)，汽蒸1、汽蒸2及CK茶砖的咖啡碱含量变化趋势基本一致，含量分别降低了9.08%、11.66%、7.83%；发花第10 d至成品茶，第二次汽蒸后茶砖的咖啡碱含量下降最显著，减少至20.08 mg/g，下降了43.37%，CK减少了31.27%.咖啡碱含量的降低与茯砖茶中冠突散囊菌的活动息息相关[9]，冠突散囊菌活动越剧烈，咖啡碱含量下降越明显，因为咖啡碱化学性质虽稳定，但在微生物酶促作用及湿热环境条件下，咖啡碱会转化成可可碱或其他茶叶碱等，还可以与多酚类物质复合，与酸生成盐等.咖啡碱是茶叶中主要的苦味物质，有多种保健功效，少量咖啡碱的摄入有助于提神、抗菌、抗癌等作用，过多的摄入则会产生毒害作用[10].

图3 茯砖茶加工过程中咖啡碱含量的变化

2.6 茯砖茶加工过程中EGCG含量结果分析

由图4可知，茯砖茶加工过程中EGCG的含量均呈现下降趋势，其中第二次汽蒸后接种茶砖的EGCG含量下降最明显，减少了87.88%，汽蒸1与CK的下降变化相当，分别减少79.62%、73.66%.两次汽蒸相比，第二次汽蒸后接种茶砖的EGCG含量下降速度更快，EGCG含量的减少有助于茶叶涩味的降低，从EGCG含量的变化及发花效果可知：第二次汽蒸后接种比第一次汽蒸后要好.EGCG含量下降的原因是：酯型儿茶素在湿热作用及水解作用下分解成简单儿茶素和没食子酸，简单儿茶素再通过自动氧化及微生物酶促作用转化成茶褐素、茶黄素和茶红素等物质[11]，使茶汤滋味由苦涩变醇和，汤色由暗黄变红橙，汤味也更加浓纯有味，提高了茶叶的品质.

两种加工阶段接种茶砖的EGCG含量变化情况存在差异，这与冠突散囊菌的生长繁殖代谢也有密切关系，冠突散囊菌的数量越多，其酶促作用越强，EGCG含量的下降速度也就越明显.研究表明，EGCG具有抗癌、抗氧化、抗突变、调理内分泌及免疫系统等生物活性[12]，还可以通过调节脂质代谢而抑制动脉粥样硬化的发展[13].

图4 茯砖茶加工过程中EGCG含量的变化

2.7 茯砖茶加工过程中茶多酚含量结果分析

由图5可知，从拼配料到成品茶，茶多酚含量减少的顺序为：汽蒸2>汽蒸1>CK，分别下降了31.98%、26.90%、25.22%，第二次汽蒸后接种茶砖的茶多酚含量下降趋势最明显，汽蒸1与CK的茶多酚含量下降趋势相对较缓.拼配料中茶多酚的含量为20.76%，成品茶中茶多酚含量降低至14%～15%.茶多酚是茶叶中三大特征性成分之一，易发生自动氧化，也会在微生物酶促作用下被降解分解，因此其含量是一直减少的[14].茶多酚具有很好的保健功效，如抗氧化、抗高血脂及延缓衰老等，有关茶多酚的研究目前也是药学领域的研究热点[15-17].

图5 茯砖茶加工过程中茶多酚含量的变化

3 结论

在茯砖茶生产加工的两次汽蒸后进行人工接种，并对加工过程中试验茶砖的咖啡碱和EGCG进行检测，得出HPLC的检测条件如下：流动相A甲醇，B 5×10-5mol/L KH2PO4溶液(pH=5)，A∶B=20∶80，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，进样量为20μL，咖啡碱和EGCG 的进样量在25～400μg 范围内与峰面积线性关系良好，r>0.999 0，咖啡碱和EGCG的平均加标回收率及RSD分别为98.32%、97.18%、1.96%、1.73%，高效液相色谱法简便准确，分离效果好，重复性高，可作为茯砖茶中咖啡碱和EGCG含量同时测定的方法.通过测定咖啡碱和EGCG的含量，得出第一、二次汽蒸后接种及CK成品茶的咖啡碱和EGCG的含量分别为23.63 mg/g、20.08 mg/g、24.37 mg/g、6.43 mg/g、3.79 mg/g、8.31 mg/g，其中第二次汽蒸后接种茶砖的咖啡碱减少了43.37%，EGCG减少了87.98%，茶多酚减少了31.98%，其三种成分的减少量比CK、第一次汽蒸后接种更多，成分转化最完全，茯砖茶中含有的人体易吸收的小分子物质越多，茶砖质量越好，因此第二次汽蒸后接种最适宜.

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【责任编辑：陈 佳】

Analysis of caffeine and EGCG in the Fu brick tea by HPLC

QIN Jun-zhe1, LIU Kai-li1, HUANG Ya-ya2, WANG Ya-li1, HU Xin2, DENG Yong-liang2, LIU Wen-jun2

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Shaanxi Cangshan Tea Industry Co., Ltd., Xianyang 710003, China)

Under the conditions of artificial inoculation,this paper researched the test conditions and content of caffeine and EGCG in the Fu brick tea through HPLC isocratic elution.The results showed that HPLC test conditions were as follows:mobile phase A is methanol,mobile phase B is 5×10-5mol/L KH2PO4solution (pH=5),A∶B=20∶80,the injection volume of caffeine and EGCG and peak area showed a good linear relationship in the range of 25～400μg,r>0.999 0,the average recoveries and RSD of caffeine and EGCG were 98.32%,97.18%,1.96% and 1.73% respectively,this method is of good separation effect and high repeatability,which can be used for simultaneous determination of the content of caffeine and EGCG in the Fu brick tea.On this basis,the content of caffeine in the first and the second steaming after inoculation and CK finished tea were 23.63 mg/g,20.08 mg/g and 24.37 mg/g respectively,and their EGCG content were 6.43 mg/g,3.79 mg/g and 8.31 mg/g respectively.After the second steaming inoculation was the most suitable.

Fu brick tea; HPLC; caffeine; EGCG

2016-12-20 基金项目：陕西省教育厅产业化培育计划项目(14JF001)； 咸阳市国家农业科技园区建设项目(2015K01-13)

秦俊哲(1957-)，男，陕西咸阳人,教授级高级工程师，研究方向：食品生物技术

1000-5811(2017)02-0110-04

TS272.5+4

A