KD患儿Th17/Treg细胞失衡和单核细胞趋化蛋白1的关系研究

夏 琨 王瑞耕 刘 玲 孙东明

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院,武汉430016)

KD患儿Th17/Treg细胞失衡和单核细胞趋化蛋白1的关系研究

夏 琨 王瑞耕 刘 玲 孙东明

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院,武汉430016)

目的：探讨川崎病(KD)患儿外周血CD4+CD25+调节T细胞(Treg)/辅助性T 细胞17(Th17)与单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的关系及其在KD发病中的作用机制。方法：2014年6月至2015年6月选取本院收治的48例KD患儿(恢复期 28例，急性期20例)为研究对象，另选取40例健康体检儿童为对照组，采用ELISA法测定两组血清中白细胞介素-15,17,23(IL-15,17,23)及MCP-1水平，采用流式细胞术测定两组外周血Treg/Th17细胞比例。结果：KD组患儿血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平显著高于对照组(P<0.05)，且急性期KD患儿血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平高于稳定期组。 KD组患儿Treg细胞、Treg/Th17、Th17显著高于对照组(P<0.05)，急性期KD患儿Treg细胞、Treg/Th17水平、Th17高于稳定期(P<0.05)。经Pearson单因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1与Treg/Th17呈负相关(P<0.05)。结论：Treg与Th17细胞间的失衡及MCP-1水平在KD患儿体内持续升高可能与KD病情发病及进展有密切的关系，通过测定KD患儿Treg/Th17细胞比例及MCP-1对评估患儿病情及预后具有一定的指导意义。

川崎病；Treg细胞；单核细胞趋化蛋白1

川崎病(Kawasaki disease，KD)是儿科常见的急性发热性出诊性疾病之一，患儿病理特征为中小动脉免疫性血管炎合并冠状动脉扩张、心肌梗死及猝死[1]。KD患儿急性期超抗原激活自身免疫反应导致大量炎症介质及细胞因子释放至血液中可导致小血管内皮坏死，进而引起患儿各种并发症[2]。目前关于KD发病机制尚不明确，但有目前普遍认为Treg/Th17细胞失衡与KD的发生有密切的关系[3]。近年有研究指出单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)具有调节单个核细胞黏附及进入动脉壁的双重功能[4]。因此，本研究将探讨KD患儿外周血CD4+CD25+调节T细胞(regulatory T cells，Treg)与MCP-1的关系及其在KD发病中的作用机制，旨在为KD临床防治提供指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年6月至2015年6月选取本院收治的48例KD患儿为研究对象，纳入标准：(1)患儿均符合日本川崎病中心2002年修订的诊断标准；(2)均签署知情同意书。排除临床感染性发热、心血管疾病、血液肿瘤疾病患儿。其中男 26例，女22例，年龄1个月～8岁，平均年龄(3.25±0.89)岁，其中恢复期 28例，急性期20例。另选取40例健康体检儿童为对照组，其中男 22例，女18例，年龄6个月～9岁，平均(3.69±1.12)岁，两组患儿性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

(1)KD患儿于入院次日清晨抽取静脉血3 ml，离心处理后留取上清液，对照组于检查当天抽取静脉3 ml,离心处理后留取上清液，并采用ELISA法测定两组IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平，IL-15试剂盒由上海拜力生物科技有限公司提供，IL-17试剂盒由上海圻明生物科技有限公司提供，IL-23试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供，MCP-1试剂盒由上海盈公生物技术有限公司提供，操作过程严格按照试剂盒说明书进行操作。(2)Treg/Th17细胞测定：采用流式细胞仪测定外周血CD4+Th17、Th17/Treg 、CD4+CD25+Treg比率。

2 结果

2.1 两组外周血IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平对比 KD组患儿血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平显著高于对照组(P<0.05)，且急性期KD患儿血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平高于稳定期组，见表1。

2.2 两组外周血Treg/Th17水平对比 KD组患儿Treg细胞、Treg/Th17、Th17显著高于对照组(P<0.05)。急性期KD患儿Treg细胞、Treg/Th17水平、Th17高于稳定期(P<0.05)，见表2，图1、2。

2.3 MCP-1与外周血Treg/Th17细胞比例的关系研究 经Pearson单因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1与Treg/Th17成负相关(P<0.05)，见表3。

GroupsnIL-15IL-17IL-23MCP-1KDchildren Acutephasegroup2028.63±4.891)2)30.45±5.621)2)28.25±6.321)2)412.36±42.421)2) Stablephasegroup2817.98±5.361)24.58±6.321)20.78±5.361)202.36±8.691)Normalcontrolgroup4012.02±3.4820.12±5.6917.47±4.2245.36±20.12Fvalue22.36225.25630.25224.522Pvalue0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the stable phase group,1)P<0.05;compared with the normal control group,2)P<0.05.

GroupsnTh17cell(%)Tregcell(%)Th17/Treg(%)KDchildren Acutephasegroup206.96±1.021)2)5.36±0.861)2)1.48±0.261)2) Stablephasegroup283.32±0.861)4.78±0.721)0.82±0.321)Normalcontrolgroup401.82±0.120.55±0.140.45±0.11Fvalue9.1237.8236.452Pvalue0.0000.0000.000

Note：Compared with the stable phase group,1)P<0.05;compared with the normal control group,2)P<0.05.

图1 患儿Th17细胞流式散点图Fig.1 KD children Th17 cells flow scatterplotNote: A.Normal control group；B.KD children with stable phase；C.KD acute phase.

图2 患儿Treg细胞流式散点图Fig.2 KD children Treg cells flow scatterplotNote: A.Normal control group；B.KD children with stable phase；C.KD acute phase.

表3 MCP-1与外周血Treg/Th17细胞比例的关系研究

Tab.3 Relationship between MCP-1 and peripheral Treg/Th17 cells in proportion

CellsIL-15IL-17IL-23MCP-1Th17cell0.11000.00180.12300.1450Tregcell0.11900.12500.13600.1480Th17/Treg0.32501)0.33801)0.31401)0.33601)

Note：1)P<0.05.

3 讨论

KD是儿童常见的免疫相关性血管炎症综合征，近年研究指出，KD患儿普遍存在冠状内皮功能异常并持续存在且呈弥散性分布的情况，而炎症性血管疾病是由受感染血管壁细胞与免疫细胞相互作用并维持的，因此选择灵敏度及特异度较高的血管炎症标准物将有助于对KD患儿早期诊断、预后及监测[5]。Guo等[6]对KD患儿冠状动脉进行病理检查发现血管中存在大量单核细胞浸润。卢红飞等[7]研究也指出，单核细胞在KD发病及病情进展中起到重要的作用。MCP-1属于趋化因子中的一员，具有趋化单个核细胞、淋巴细胞及自然杀伤细胞的功能。本研究结果显示，KD组患儿血清MCP-1水平显著高于对照组，且急性期KD患儿血清MCP-1水平高于稳定期组，对这种现象的解析是MCP-1参与了KD冠状动脉患者发病过程，并在体内持续较长的时间，并在KD患儿体内强烈表达，从而导致KD患儿急性期患儿血清中MCP-1水平较高[8]。

目前认为T淋巴细胞免疫功能紊乱与KD的发生及病情进展有密切的关系，免疫系统高度活化及免疫损伤性血管炎是KD的两大免疫特征，由此可以推测免疫功能紊乱在KD发生及进展中扮演重要的角色[9]。Treg细胞属于免疫调节功能T细胞亚群，主要表达细胞表面分子CD4+CD5+，其主要作用为抑制机体病理性免疫反应，介导自身免疫反应，从而维持机体内环境稳定性及免疫系统功能[10]。本研究结果显示，KD患儿外周血肿Treg水平显著低于对照组，且急性KD患儿显著低于恢复期，结果与既往研究一致，进一步表明Treg细胞在KD患儿中存在异常，导致对感染引起的效应性促炎症因子激活、T细胞活化及非特异性免疫性应答增强等免疫活化反应受到抑制，从而导致机体各系统尤其是血管系统损伤。

Th17是近年新发现的新型CD4+T细胞亚型。Th17细胞及其分泌的炎症相关因子如IL-15、IL-17、IL-23可参与机体炎症反应，并对多种免疫性疾病具有促进作用[11]。国外研究指出，在炎症行疾病患者体内血清IL-15、IL-17、IL-23显著高于正常人群[12]，在支气管哮喘小鼠模型中从肺脏组织及呼吸道灌液中明显可以检测Th17细胞及其炎症相关细胞水平显著升高。本研究结果发现，KD患儿外周血肿Th17水平显著高于对照组，急性期KD患儿血清Th17水平显著高于稳定期，这提示KD患儿体内Th17水平升高可能与其KD患儿病情发生及进展有密切的关系。经Pearson单因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1与Treg/Th17成负相关(P<0.05)，提示KD的发生除了与患儿自身免疫系统功能异常有关外，还可能与单核趋化细胞分泌异常有密切的关系，KD的发生不是单因素引起的，可能是由多个危险因素相互作用相互影响引起的，这在日后还需要扩大样本量进一步研究。

综上所述，Treg与Th17细胞间的失衡及MCP-1水平在KD患儿体内持续升高可能与KD病情发病及进展有密切的关系，通过测定KD患儿Treg/Th17细胞比例及MCP-1对评估患儿病情及预后具有一定的指导意义。

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[收稿2016-04-11 修回2017-02-03]

(编辑 张晓舟)

Relationship between Th17/Treg cells and monocyte chemoattractant protein-1 in KD children

XIAKun,WANGRui-Geng,LIULing,SUNDong-Ming.

WuhanChidren′sHospital，TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430016,China

Objective:To investigate the relationship between CD4+CD25+regulatory T cells (Treg) and monocyte chemoattractant protein-1 and its mechanism in KD pathogenesis.Methods: 48 patients of KD (28 cases of recovery,20 cases of acute phase) were admitted from June 2014 to June 2015 and the other 40 cases of healthy children was admitted to control group.The levels of serum interleukin-15,17,23 (IL-15,17,23) and MCP-1 of two groups were measured with ELISA.The levels of Treg/Th17 cell ratio of two groups were measured with flow cytometry.Results: The levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 of KD group were higher than control groups(P<0.05) and the levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 of acute phase groups were higher than recovery groups.The levels of Th17,Treg cells,Th17/Treg of KD group were lower than the control group (P<0.05),while the levels of Th17,Treg cells,Th17/Treg cells in the acute phase of KD patients were higher than stable phase.The levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 and Treg/Th17 were negative correlation with univariate analysis by Pearson(P<0.05).Conclusion: The imbalance between Treg and Th17 cells and MCP-1 levels continue to rise may be associated with KD onset and progress of the disease is closely related to children in KD vivo by measuring children with KD Treg/Th17 cells and MCP-1 ratio of assessment Children with the condition and prognosis has some significance.

Kawasaki disease;Treg cells;Monocyte chemoattractant protein-1

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.024

夏 琨(1977年-)，女，主治医师，主要从事儿童心血管疾病方面的研究。

及指导教师：孙东明(1971年-)，男，硕士，副主任医师，主要从事儿童心血管疾病方面的研究。

R725.9

A

1000-484X(2017)03-0429-04