精氨酸单糖苷(AF)对免疫抑制小鼠免疫功能的影响①

宋明铭 王佳奇 黄宝亮 高铭彤 李婧毓 丁传波 郑毅男 刘文丛 徐晓华

(吉林农业大学，长春130118)

精氨酸单糖苷(AF)对免疫抑制小鼠免疫功能的影响①

宋明铭 王佳奇 黄宝亮 高铭彤 李婧毓 丁传波 郑毅男 刘文丛 徐晓华

(吉林农业大学，长春130118)

目的：研究精氨酸单糖苷(Arginyl-fructose，AF)对环磷酰胺(CTX)诱导的免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法： ICR小鼠100只，随机分成5组，即正常对照组(N)，免疫抑制模型组(M)，免疫抑制AF低、中、高剂量组(M-L、M-M、M-H)。试验组连续给药28 d。免疫抑制组，每周前3天，腹腔注射80 mg/kg环磷酰胺，形成免疫抑制。末次给药12 h解剖后，测定免疫器官指数，AF对脾淋巴细胞转化及增殖、巨噬细胞吞噬功能、特异性IgG抗体、血清中TNF-α 、IL-2含量的影响。并通过实时荧光定量PCR检测TNF-α 、IL-2 基因表达的差异。结果：AF能够显著提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数，促进脾淋巴细胞的自然转化与增殖，增强巨噬细胞吞噬功能，显著提高小鼠血清中特异性IgG抗体含量，可显著提高小鼠血清中TNF-α、IL-2含量，实时荧光定量PCR检测结果显示，TNF-α、IL-2 mRNA能够良好表达。结论：AF能拮抗CTX免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。

精氨酸单糖苷；ICR小鼠；免疫；荧光定量PCR

精氨酸单糖苷(Arginyl-fructose，AF)，是郑毅男等[1]首次从鲜参加工成红参的过程中获得，为美拉德反应中间产物的非褐变部分，是精氨酸与葡萄糖羟醛脱水缩合的产物[2,3],分子量为337.3。AF纯品为白色粉末，极易溶于水，不溶于甲醇等有机溶剂。实验研究表明，AF具有抗氧化[4,5]、抗肿瘤[6]、促进微循环等功能[7]，而且具有抑制葡萄糖苷酶、抗糖尿病等作用[8]。

李敏珍等[9]报道，红参类药物有增强机体免疫功能作用。Yool等[10]报道，红参能够平衡体内免疫系统，调节免疫机能，抵抗疾病侵袭。AF在红参中含量丰富，所以通过此次试验，探讨AF是否在红参的免疫活性中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料、试剂 万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；荧光定量PCR仪电泳仪(北京六一)；MX3000 RT-PCR仪(美国 Stratagene)；PCR仪(美国SBP公司)；琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计；TGL-20B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；凝胶成像仪(美国BIORAD公司)；MK3型酶标仪(美国Thermo Electron公司)。

IL-2和TNF-α试剂盒(美国R&D公司，长春百金生物科技公司分装)。高纯总RNA快速提取试剂盒、2×Power Taq PCR Master Mix、Bio Take super RT Kit、2×SYBP Real-time PCR premixture(北京百泰克生物技术有限公司)。

精氨酸单糖苷AF，自制，纯度大于95%，临用时用纯净水配制成低、中、高剂量所需浓度；4周龄ICR小鼠，SPF级(18～22 g)，购自吉林省亿斯实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与剂量 100只ICR小鼠，适应性饲养1周后，随机分成5组，每组20只，即正常对照组(N)，免疫抑制模型组(M)，免疫抑制 AF低剂量组(M-L，20 mg/kg)，免疫抑制AF中剂量组(M-M，40 mg/kg)，免疫抑制 AF 高剂量组(M-H，80 mg/kg)。各组每日按10 ml/kg体重给小鼠灌胃给药，每天给药1次，连续给药28 d。M、M-L、M-M及M-H组，每周前3 d，腹腔注射环磷酰胺(CTX，80 mg/kg)，形成免疫抑制。

1.2.2 小鼠免疫器官脏器指数测定 末次给药12 h后，眼球取血，离心机4 500 r/min分离血清，处理后的血清保存在-20℃冰箱，待用。将小鼠处死后进行系统的解剖，取出脾脏和胸腺，用9%生理盐水进行漂洗，滤纸吸干后称重，计算脾指数及胸腺指数。脏器指数=脏器重量(g)× 100/体重(g)。

1.2.3 脾淋巴细胞转化试验 给药第21天后，每组随机抽取10只小鼠，脱臼处死，置75%酒精中浸泡5 min,无菌取脾脏，加入RPMI1640，300目钢网研磨，吸取脾细胞悬液于1.5 ml离心管中，离心10 min(1 500 r/min，4℃)，弃上清液。于上述离心管中加入ACK Lysis Buffer，再次离心10 min(1 500 r/min，4℃)，弃上清液。再加入RPMI1640，细胞计数，配成2×106ml-1脾细胞悬液。试验分为3组，第1组为对照组即脾淋巴自然转化组；第2组加入ConA(5 μg/ml,100 μl)，刺激T细胞转化；第3组加入LPS(10 μg/ml,100 μl)，刺激B细胞转化。将各组细胞依次加到 96 孔板中，每孔加入100 μl脾细胞悬液，每孔设立3个复孔。细胞培养条件为：5%CO2培养箱，37℃，48 h。培养48 h后，每孔内加入MTT(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h后，离心(2 000 r/min，10 min)，吸取上清液，加入150 μl的DMSO充分溶解结晶，酶标仪490nm条件下，测定各孔OD值。

1.2.4 体外脾淋巴细胞增殖试验 ICR小鼠，脱臼处死，取脾方法如1.2.3所述。试验分为空白组、阴性对照组、阳性对照组及AF加药组(浓度分别为：1、2、4、6、8、10 μg/ml)。每组设立3个复孔，空白组加入培养基100 μl，其他组别加入细胞悬液100 μl于96孔板中。培养1 h后，于空白及阴性对照组各加入培养基100 μl，阳性对照组加入ConA(50 μg/ml，10 μl)，加药组加入相应浓度AF。培养条件与其余步骤，如1.2.3所述。

1.2.5 腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测 ICR小鼠，脱臼处死，置75 %酒精中浸泡5 min，无菌条件下剪开腹部，使腹膜壁暴露，用75 %乙醇冲洗腹壁。之后无菌抽取1 ml消毒空气及4 ml冷PBS注入腹腔，最后抽取腹腔悬液，离心2次(1 500 r/min 4℃，10 min)，每次离心后弃去上清液，用PBS洗涤。末次洗涤后，再加入RPMI1640，细胞计数，配成2×106ml-1脾细胞悬液。吸取100 μl细胞悬液于96孔板的各孔，5%CO2培养箱培养(37℃、2 h)，贴壁细胞即为巨噬细胞，未贴壁用37℃PBS洗去。

试验设置AF加药组(浓度分别为：1、2、4、6、8、10 μg/ml)与空白对照组。每组设立3个复孔，空白对照组加入培养基200 μl，其他分别加入不同浓度的AF 200 μl于96孔板中。5%CO2培养箱培养(37℃、24 h)，弃去上清液，用37℃ PBS 200 μl/孔洗3遍，加入0.075%中性红溶液200 μl/孔，培养箱中培养30 min弃去上清液，用37℃ PBS 200 μl/孔洗3遍，每孔加200 μl细胞裂解液(1 mol/L醋酸∶无水乙醇=1∶1)培养1 h，540nm测其吸光度值。吞噬中性红增加率(%)=(A给药-A对照)/A对照×100%。

1.2.6 血清TNF-α、IL-2含量测定 取分装好的小鼠血清，常温解冻，严格按照ELISA说明书操作，点入96孔板，酶标仪测定后，进行数据处理分析。

1.2.7 特异性IgG抗体的检测 取分装好的小鼠血清，常温解冻，ELISA法测定小鼠特异性IgG抗体水平。

1.2.8 荧光定量RT-PCR测定

1.2.8.1 组织中RNA提取 ①取出各组小鼠保存在液氮中的脾脏组织，在DEPC水处理后的研钵中充分研磨至粉末状。②1 ml Trizol于1.5 ml离心管中，再加入少许脾脏粉末，振荡器充分混匀后，静置5 min；③加200 μl氯仿于上述离心管中，盖紧，用手颠倒混匀后，室温放置10 min，12 000 r/min离心15 min 4℃；④吸出上清液于新的1.5 ml离心管中，加500 μl异丙醇，混匀，室温静置10 min后，12 000 r/min 4℃离心10 min，保留沉淀。⑤加75%冷乙醇1 ml于上述沉淀离心管中，充分洗涤沉淀，7 500 r/min 4℃离心5 min，弃上清；⑥室温干燥RNA至半透明状；⑦向离心管中加20 μl DNase/RNase-Free Deionized Water溶解沉淀，-80℃冻存。RNA提取图，见图1。

1.2.8.2 反转录合成cDNA TNF-α、IL-2的基因序列从数据库NCBI获得，参照查询的基因序列使用Primer5.0软件设计TNF-α 、IL-2定量引物，反转录引物使用试剂盒中的随机引物，荧光定量引物序列见表1。

按照东洋纺试剂盒说明书步骤，进行反转录试验，得到cDNA产物，于-80℃保存。反转录加样体系见表2。

1.2.8.3 实时荧光定量反应 以GAPDH为内参引物，采用荧光染料SYBR-GreenⅠ检测TNF-α 、 IL-2在小鼠脾脏组织中相对表达量，每个样品3个重复。扩增反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃反应10 s，60℃反应30 s，40个循环。反应结束后，记录溶解曲线和扩增曲线，每孔样本的Ct值，使用2-ΔΔCt方法计算。反应体系见表3。

图1 RNA提取图Fig.1 Picture of RNA extraction

表1 荧光定量引物序列

Tab.1 Sequences of fluorescence quantitative primers

SymbolSequence(5'-3')m-qPCR-TNF-α-F2CTTCTCATTCCTGCTTGTGGCm-qPCR-TNF-α-R2CTTGGTGGTTTGCTACGACGm-IL-2-F1ACCGATTTCTGGCTAGTGAGGm-IL-2-R1GCAGTTGTTTCTGTGGGTTGTm-GAPDH-FCGGCAAATTCAACGGCACAm-GAPDH-RCACCAGTAGACTCCACGACAT

2 结果

2.1 AF对小鼠免疫器官脏器指数的影响 与M组比较，N、M-L、M-M组胸腺指数、脾脏指数均存在显著统计学意义(P<0.01)，M-H组无明显变化，见表4。

2.2 AF对脾淋巴细胞转化的影响 从图2可知，T淋巴细胞转化刺激剂为ConA，与M组比较，M-L组具有极显著统计学意义(P<0.01)，M-M组存在显著统计学意义(P<0.05)，M-H组与M组无明显统计学意义。B淋巴细胞转化的刺激剂为LPS，与M组比较，M-L组具有显著统计学意义(P<0.01)，M-M组存在显著统计学意义(P<0.05)，M-H组与M组差异无明显统计学意义。

2.3 AF对体外脾淋巴细胞增殖的影响 不同浓度AF对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响，如图3所示。随着AF浓度的增加，脾淋巴细胞的增殖活性逐渐增强。与阴性对照组比较，AF浓度为6、8、10 μg/ml时，呈现极显著性(P<0.01)。

2.4 AF对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 如表5所示，AF能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红。与对照组比较，AF浓度为6、8、10 μg/ml时，呈现极显著性(P<0.01)。AF浓度为4 μg/ml时，存在显著性(P<0.05)。

2.5 AF对小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-2的影响 如图4所示，与M组比较，N组血清中TNF-α含量显著上升(P<0.01)，呈极显著性，M-L、M-M组血清中TNF-α含量升高(P<0.05)，M-H组TNF-α含量与M组差异无统计学意义。与M组相比，M、M-L组血清中IL-2含量明显升高(P<0.05)，M-M组IL-2含量升高(P<0.05)，M-H组IL-2 含量与M组差异无统计学意义。

2.6 AF对小鼠特异性IgG抗体的影响 结果显示，M、M-L、M-M组小鼠获得的免疫应答良好，与M组小鼠比较，抗体水平极显著性提高(P<0.01)，M-H组无明显变化，见图5。

表2 反转录加样体系

Tab.2 Reverse transcription reaction system

ReagentSampleadditionTotalRNA7.0μlPrimermix0.5μlRTenzymemix0.5μl5×RTbuffer2.0μlTotal10.0μl

表3 RT-PCR反应体系

Tab.3 Real-time PCR reaction system

ReagentSampleadditionSYBRgreenmix12.5μlH2O9.5μlF0.5μlR0.5μlTotal25.0μl

GroupsDose(mg/kg)nThymusweight(mg)Thymusindex(mg/g,%)Spleenweight(g)Spleenindex(mg/g,%)Normalgroup-1555.42±0.012)0.18±0.012)0.18±0.062)0.65±0.052)Modelgroup801522.63±0.010.10±0.020.13±0.020.40±0.02M-Lgroup201552.95±0.012)0.16±0.022)0.16±0.171)0.52±0.092)M-Mgroup401541.72±0.022)0.14±0.022)0.15±0.030.64±0.062)M-Hgroup801531.15±0.020.11±0.020.13±0.040.44±0.10

Note：1)P<0.05,2)P<0.01,compared with model.

图2 AF对小鼠脾淋巴细胞转化的影响Fig.2 Effect of AF on transformation of mouse spleen cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

图4 AF对小鼠血清中细胞因子TNF-α 、IL-2的影响Fig.4 Effects of AF on serum TNF-α and IL-2 in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

GroupsDosage(μg/ml)A540Increasingrate(%)Control-0.343±0.02-AF10.343±0.020.087AF20.343±0.030.117AF40.349±0.031)1.672AF60.405±0.052)18.17AF80.435±0.022)26.82AF100.472±0.032)37.52

Note：1)P<0.05,2)P<0.01,compared with normal.

图3 AF对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Fig.3 Effect of AF on proliferation of mouse spleen cellsNote: **.P<0.01,compared with normal.

图5 AF对小鼠特异性IgG抗体的影响Fig.5 Effects of AF on serum IgG in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

2.7 AF对小鼠脾脏组织中TNF-α、IL-2 mRNA表达的影响 荧光定量PCR结果显示，TNF-α、IL-2熔解曲线为单一峰,扩增曲线均为典型S型,基线平整。M-L组TNF-α、IL-2 mRNA表达分别为(7.73±0.16)、(10.63±0.34)，M-M组TNF-α、IL-2 mRNA表达分别为(2.6±0.03),(5.43±0.23)，显著高于M组[(1.83±0.72)、(2.45±0.02)](P<0.01、P<0.05)，如图6。

图6 AF对小鼠脾脏组织中TNF-α 、IL-2 mRNA表达的影响Fig.6 Effects of AF on TNF-α,IL-2 mRNA expression in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

3 讨论

本研究显示，ICR小鼠给药28 d后，显著提高了免疫抑制小鼠脾脏及胸腺指数；M-L组显著促进脾淋巴细胞转化，体外脾淋巴细胞增殖，显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能；M-L、M-M组小鼠特异性IgG抗体明显高于M组；免疫抑制小鼠血清中，肿瘤坏死因子TNF-α及IL-2的含量显著提高。且通过实时荧光定量PCR检测，TNF-α及IL-2 mRNA水平明显增高。

本试验以体内给药研究方式结合实时荧光定量PCR等体外试验进行研究，结果表明，AF可减轻CTX造成的免疫器官萎缩现象。从免疫应答来看，本试验中免疫抑制AF低剂量组、免疫抑制AF中剂量组小鼠特异性IgG抗体水平明显高于免疫抑制模型组小鼠，Guy等[11]研究表明，特异性IgG抗体是血清主要的抗体成分，可清除有害补体片段，抑制炎症反应在机体免疫中起保护作用。本研究的IgG水平表明，AF能提高免疫抑制小鼠免疫应答能力。刘佳[12]和赵定亮[13]报道，IL-2能促进T、B淋巴细胞的增殖与分化，可诱导杀伤细胞(LAK)的产生。可以增强机体免疫监视功能。谭兵[14]和李卫[15]报道，TNF-α能够抵抗微生物入侵和调节机体免疫的功能。此次试验，用ELISA试剂法，检测出AF免疫抑制组小鼠血清中IL-2、TNF-α含量显著提高。同时，采用荧光定量PCR，检测TNF-α及IL-2 mRNA水平。以上试验结果表明，AF具有较强的免疫增强能力，能拮抗CTX免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。但本次试验，只是免疫研究中的一部分，应进一步探讨研究，以充分证实试验结果。

[1] 郑毅男,松浦幸永,韩立坤,等.红参中新化合物-精氨酸衍生物的分离与结构鉴定[J].药学学报,1996,31(3):191-195.

[2] Takaku T,Han LK,Kameda K,etal.Production of arginyl-frictosyl glucose during proce-ssing of red ginseng Tradit[J].Med,1996,13：118-123.

[3] Suzuki Y,Choi KJ,Uchida K,etal.Arginyl-fructosyl-glucose and arginyl-fructose compo-unds related to browning reaction in the model system of steaming and heat-drying processes for the preparation of red ginseng[J].J Ginseng Res,2004,28,143-148.

[4] Cho EJ,Piao XL,Jang MH，etal.The effect of steaming on the free amino acid contents and antioxidant activity of Panax ginseng[J].Food Chem，2008,107:876-882.

[5] Kim GN,Lee JS,Song JH,etal.In vitro and cellular antioxidant activity of arginyl-fructose and arginyl-fructosyl-glucose[J].Food Sci Biotechnol，2009,18(6),1505-1510.

[6] Keum YS,Park KK,Lee JM,etal.Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng[J].Cancer Lett,2000,150,41-48.

[7] 郑毅男，张 晶，奥田拓道，等.精氨酸衍生物对微循环的作用[J].吉林农业大学学报，1998, 20(4)：45-47.

[8] Kwang-Hyoung L,Kyoung-Soo H,Sung-Hoon J,etal.Effect of long-term dietary arginyl-fructose (AF) on hyperglycemia and HbA1c in diabetic db/db mice[J].Mol Sci,2014,15,8352-8359.

[9] 李敏珍,何晓帆,曹治金,等.高丽参、西洋参、红参对小鼠免疫功能的影响比较[J].广西中医药,1989，12(5)：52-55.

[10] Yool BC,Park GH,Okuda H,etal.Inhibitory effect of arginine-derivatives from ginseng extract and basic amino acids on protein-arginine N-methyltransferase[J].Amino Acids,1999,17:391-400.

[11] Guy B,Hessler C,Fourage S,etal.Systemic immunization with urease protects mice against Helicobacter pylori infection[J].Vaccine,1998,16(8):850-856.

[12] 刘 佳，单安山，孙进华.白细胞介素-2的研究进展与应用[J].黑龙江畜牧兽医，2009，21：57-61.

[13] 赵定亮,单风平.细胞介素-2最新研究进展[J].微生物学杂志，2013，33(4):77-79.

[14] 谭 兵,李瑜元,聂玉强.肿瘤坏死因子-α的研究进展[J].国际内科学杂志，2007,5(3):129-133.

[15] 李 卫，刘 佳，白家媛.α肿瘤坏死因子的研究进展[J].动物医学进展，2010,31(12):12-14.

[收稿2016-02-23 修回2016-04-25]

(编辑 许四平)

Protective effect of Aginyl-fructose immunosuppression in mice

SONGMing-Ming,WANGJia-Qi,HUANGBao-Liang,GAOMing-Tong,LIJing-Yu,DINGChuan-Bo,ZHENGYi-Nan,LIUWen-Cong，XUXiao-Hua.

JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China

Objective:To study the effect of AF on mice induced by cyclophosphamide.Methods: 100 ICR mice were divided into 5 groups randomly,the normal contral group(N),immunosuppressive model group(M)，AF low-dose group(M-L,20 mg/kg)，AF middle-dose group(M-M,40 mg/kg)，AF high-dose group(M-H,80 mg/kg).Drugs were chronically administered to mice for 28 days,dosage of administration was 10 ml/kg of the mice′s weight.The groups of M，M-L，M-M，M-H received an injection of cyclophosphamide (CTX,80 mg/kg) three times a week to cause immunosuppressive.Organ idex，splenic lymphocyte transformation，phagocytic function，IgG，IL-2，TNF-α were conducted 12 hours after the last administration in mice of each group.Results: AF could improve the thymus index and spleen index in mice significantly，promoting the natural transformation and proliferation of splenic lymph-ocytes,adding phagocytic function,AF could improve the content of IgG，IL-2，TNF-α in serum significantly.The result of Real-time fluorescence quantitative PCR show that TNF-α mRNA，IL-2 could be well expressed.Conclusion: AF can inhibit hypoimmunologic mice induced by CTX.

Arginyl-fructosyl；ICR mice；Immune；Fluorogenic quantitative PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.006

①本文受吉林省自然科学基金(20160101017JC)、吉林大学生创业资金项目(20160521011HJ)和延边州科技发展计划项目(2015JH01)资助。

宋明铭(1991年-),女,硕士,主要从事为中药新药研究与开发方面的研究，E-mail：15144090081@163.com。

及指导教师：刘文丛(1968年-),男,博士,教授,主要从事中药新药研究与开发方面的研究，E-mail:jwlw6803@126.com。 徐晓华(1968年-)，女，副主治医师，主要从事糖尿病肾病方面的研究，E-mail：xuxiaohua681002@qq.com。

R151.3

A

1000-484X(2017)03-0347-05