免疫抑制剂对巨噬细胞Dectin-1和TLR2表达的影响

毛亚男 王 雯 王 东 张 波

(安徽医科大学,合肥230032)

免疫抑制剂对巨噬细胞Dectin-1和TLR2表达的影响

毛亚男 王 雯①王 东①张 波

(安徽医科大学,合肥230032)

目的：研究地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯对小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1和TLR2受体表达的影响。方法：体外培养RAW264.7巨噬细胞，分别给予不同浓度的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯刺激细胞24 h，CCK-8检测RAW264.7细胞毒性作用，RT-PCR检测细胞Dectin-1和TLR2 mRNA表达情况，流式细胞术检测Dectin-1和TLR2蛋白水平变化。结果：不同剂量的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯作用细胞24 h后均对细胞表现出一定的毒性作用(P<0.05)，且随着药物浓度增加毒性作用越大。地塞米松降低Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表达，上调TLR2受体转录和翻译(P<0.05)；环磷酰胺对巨噬细胞Dectin-1和TLR2的转录翻译无明显影响(P>0.05)；霉酚酸酯和环孢素A能够同时下调Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平表达(P<0.05)。结论：不同免疫抑制剂对模式识别受体表达的调节作用具有差异性，通过选择性调节各自靶点PRRs的表达抑制机体对各种真菌病原体的免疫识别过程，同时也能够抑制巨噬细胞的生长增殖，共同介导免疫抑制功能。

免疫抑制剂；Dectin-1；TLR2；巨噬细胞

天然免疫细胞、模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)及细胞因子等共同构成了复杂有机的先天性免疫网络系统。病原微生物入侵机体后，其表面病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMP)首先激活巨噬细胞等天然免疫前哨细胞表面的PRRs,进而活化细胞内部相应的信号转导通路、分泌细胞因子、趋化中性粒细胞等吞噬细胞到达感染部位，诱导局部炎症反应，吞噬、杀灭并清除入侵的致病微生物[1]。近期研究发现，C型凝集素受体家族成员Dectin-1和TLR2在抗真菌感染免疫反应中发挥重要作用，成为真菌感染免疫领域研究的热点[2]。

免疫抑制剂是器官移植及自身免疫性疾病的常规用药，其中地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯是目前临床常用的四种免疫抑制剂，通过不同的作用机制抑制机体的免疫功能。众所周知，长期应用免疫抑制剂造成的侵袭性真菌感染一直是免疫抑制患者面临的重要问题，严重威胁着免疫抑制患者的生存。有关免疫抑制剂对模式识别受体Dectin-1和TLR2调节作用的研究报道很罕见。本实验以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象，探讨上述四种免疫抑制剂对Dectin-1和TLR2表达的影响，从模式识别水平了解不同免疫抑制剂引起真菌感染作用机制之间的区别。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠RAW264.7巨噬细胞购自南京凯基生物公司细胞库；环磷酰胺购自Sigma公司；霉酚酸酯、环孢素A购自大连美仑生物技术有限公司；地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀药业有限公司；超纯RNA提取试剂盒，HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，PCR Mixture(CWbio.Co.Ltd)；抗小鼠 PE-Dectin-1 抗体，抗小鼠PE-TLR2抗体(Miltenyi biotec)；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及CCK-8细胞增殖毒性实验 快速复苏细胞，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5%CO2孵箱中培养，0.25%EDTA胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期状态良好的细胞以1×105个/ml密度接种于96孔板中，每孔加100 μl 细胞悬液，边缘孔以PBS缓冲液填充，培养24 h至细胞贴壁后进行药物干预。实验分组如下：空白对照组：等量完全培养基；地塞米松：(20、50、100、200、500 μg/ml)；环磷酰胺：(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/ml)；环孢素A：(2.5、5、10、20、50 μg/ml)；霉酚酸酯：(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/ml)。干预24 h后弃净原培养基，每孔加入110 μl CCK-8工作液(10 μl CCK-8溶液/100 μl完全培养基比例配制)继续培养2 h。测定450nm吸光度，计算细胞存活率，分析不同免疫抑制剂对小鼠RAW264.7细胞毒性的影响。

1.2.2 药物干预及实验分组 实验分5组：①空白对照组：加入等量完全培养基；②地塞米松组：分别加入不同浓度地塞米松(20、50、200 μg/ml)；③环磷酰胺组：分别加入不同浓度环磷酰胺(0.05、0.2、0.5 μg/ml)；④环孢素A组：分别加入不同浓度环孢素A(2.5、5、10 μg/ml)；⑤霉酚酸酯组：分别加入不同浓度霉酚酸酯(0.1、0.25、0.5 μg/ml)。干预24 h后，结束药物刺激。提取细胞总RNA采用RT-PCR检测细胞Dectin-1和TLR2 mRNA表达水平的变化；收集细胞利用流式细胞技术检测不同免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表达的影响。

1.2.3 RT-PCR检测Dectin-1、TLR2 mRNA表达 按照超纯RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。按照世纪康为HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒要求进行反转录，PCR扩增程序为：95℃预变性5 min→(95℃变性15 s→ 60℃退火/延伸1 min)×40个循环。引物由上海生工设计合成，序列如下：①Dectin-1 ：(F)5′-AGACTTCAGCACTCAAGACATCCA-3′，(R)5′-CAGGATTCCTAAACCCACTGCAA-3′；②TL-R2：F5′-CCCACTTCAGGCTCTTTGAC-3′，(R)5′-GCCACTCCAGGTAGGTCTTG-3′；β-actin：(F)5′-TGAA-GATCAAGATCATTGCTCCTCC-3′，(R)5′-CTAGA-AGCATTTGCGGGGACGATG-3′。待反应结束后，采用2-ΔΔCT进行相对定量分析。

1.2.4 流式细胞术检测Dectin-1、TLR2蛋白的表达 干预24 h后，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化细胞并转移至流式管中，PBS漂洗后重悬细胞，分别加5 μl抗小鼠PE-Dectin-1抗体和抗小鼠PE-TLR2抗体，室温避光20 min进行荧光标记染色，PBS漂洗离心，弃掉残余抗体，上机检测各组细胞的平均荧光强度。

2 结果

2.1 不同种类和剂量免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞活性的影响 CCK-8细胞增殖-毒性试验结果(如图1)显示：地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯作用细胞24 h后均对细胞表现出一定的毒性作用，且随着药物浓度的增加，毒性作用越大。所有加药组的细胞生存率与空白对照组比较，P<0.05，差异均有统计学意义(见表1)。

2.2 不同种类和剂量免疫抑制剂对细胞Dectin-1、TLR2 mRNA表达的影响 如图2所示，实验发现不同剂量的地塞米松、环孢素A和霉酚酸酯单独干预24 h后，RAW264.7巨噬细胞中Dectin-1 mRNA表达水平较空白对照组相比都降低(P<0.05)，而三种浓度的环磷酰胺对细胞中Dectin-1 mRNA的表达无明显影响(P>0.05)；图3结果显示：地塞米松单独干预RAW264.7巨噬细胞24 h后，低、中、高三种浓度的地塞米松均能提高细胞TLR2 mRNA的表达水平(P<0.05)，尤以50 μg/ml浓度作用最为明显。低、中、高三种浓度的环孢素A和霉酚酸酯均能下调巨噬细胞TLR2 mRNA的表达(P<0.05)，不同剂量(0.05、0.2、0.5 mg/ml)的环磷酰胺刺激细胞24 h后，TLR2 mRNA水平与空白对照组比较，P>0.05，差异无统计学意义。

图1 四种免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响Fig.1 Effects of four immunosuppressants on proliferation of RAW264.7 cellsNote: DEX.Dexamethasone；CTX.Cyclophosphamide； CsA.Cyclosporin A； MMF.Mycophenolate mofetil.

GroupsCellsurvivalrate(%)Controlgroup100DEX10μg/ml93.16±4.021)DEX50μg/ml90.52±3.071)DEX100μg/ml77.16±6.321)DEX200μg/ml65.41±8.251)DEX500μg/ml37.73±6.461)CTX0.05mg/ml101.03±7.131)CTX0.2mg/ml90.80±7.211)CTX0.5mg/ml70.77±1.521)CTX1.0mg/ml64.90±9.661)CTX2.0μg/ml35.90±2.831)CsA2.5μg/ml90.40±7.711)CsA5μg/ml74.01±4.541)CsA10μg/ml66.57±7.781)CsA20μg/ml59.12±9.131)CsA50μg/ml33.03±6.061)MMF0.1μg/ml97.40±3.66MMF0.25μg/ml69.33±2.231)MMF0.5μg/ml59.60±5.081)MMF1.0μg/ml33.42±8.801)MMF2.0μg/ml5.69±0.511)

Note：Compared with the control group,*.P<0.05.

图2 四种免疫抑制剂对RAW264.7细胞Dectin-1 mRNA的影响Fig.2 Effect of immunosuppressants on expression of Dectin-1 ±s,n=6)Note: Compared with the control group,*.P<0.05.

图3 四种免疫抑制剂对RAW264.7细胞TLR2 mRNA的影响Fig.3 Effect of immunosuppressants on expression of TLR2 ±s,n=6)Note: Compared with the control group,*.P<0.05.

图4 四种免疫抑制剂对RAW264.7细胞Dectin-1(A-D)、TLR2(E-H)蛋白平均荧光强度的影响Fig.4 Effects of four immunosuppressants on MFI of Dectin-1(A-D)，TLR2(E-H) protein on RAW264.7 macrophagesNote: Gray lines.The control group;Black lines.The experiment group.

2.3 不同种类和剂量免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表达的影响 流式细胞术检测结果如下图(图4A～4H)所示：RAW264.7巨噬细胞自身表达极低水平的Dectin-1蛋白，TLR2表达水平明显高于Dectin-1蛋白水平。200 μg/ml的地塞米松干预RAW264.7细胞24 h后，细胞表面Dectin-1蛋白表达水平较空白对照组明显降低(P<0.05)，TLR2蛋白水平升高(P<0.05)，差异具有统计学意义；环磷酰胺处理后细胞表面Dectin-1和TLR2蛋白荧光强度与空白组无明显变化(P>0.05)；而10 μg/ml的环孢素A以及0.5 μg/ml的霉酚酸酯单独刺激细胞24 h后，细胞表面Dectin-1和TLR2蛋白的荧光强度与对照组比较显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

免疫抑制剂在临床上应用广泛，主要用于治疗自身免疫性疾病以及移植术后的急性排斥反应，促进移植物的存活。然而长期大量应用免疫抑制剂则会造成患者免疫力低下，真菌感染的发病率和病死率明显增加，严重威胁免疫抑制患者的生存。免疫抑制剂种类繁多，根据作用方式可将其分为皮质类固醇家族抗炎药、钙调神经蛋白抑制剂、细胞毒性或抗增殖性药物以及特异性抗体。地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯是目前临床上最为常用的具有代表性的四种免疫抑制剂，通过不同的作用机制抑制免疫细胞的功能，而这些免疫抑制作用是否涉及调节天然免疫系统对病原微生物PAMPs的模式识别过程以及不同免疫抑制剂对模式识别受体影响之间的差别目前尚不明确。

PRRs对真菌病原体PAMPs的识别过程是抵御真菌感染的始动环节，进一步启动机体的先天性免疫反应和适应性免疫反应[3]，TR2和C型凝集素受体Dectin-1是天然免疫系统中的重要PRRs，能够识别一系列真菌病原体，协同诱导产生高效的抗真菌免疫反应，在宿主的防御机制中发挥着核心性的作用[2]。Dectin-1和/或TLR2受体发生基因突变、缺失或受到抑制都将会导致机体抵御真菌感染的能力减弱。早前有学者发现Dectin-1缺陷的造血干细胞移植受体[4]以及Dectin-1早期终止密码子Y238X突变患者[5]，更容易罹患侵袭性真菌感染。Dectin-1参与真菌感染的重要性在小鼠模型中也得到了证明：Dectin-1缺陷导致机体无法启动有效的炎症反应来控制真菌的播散[6]。气管内接种烟曲霉孢子的TLR2基因敲除小鼠较正常组而言呼吸窘迫症状更加严重，真菌负荷也明显高于对照组[7]。而新型隐球菌感染TLR2-/-和Myd88-/-小鼠模型，感染动物体内炎性因子TNF-α、IL-12p40和/或IFN-γ水平明显减少[8]。这些结果充分说明了Dectin-1和TLR2在机体抵抗真菌感染性疾病方面的重要性。

地塞米松是具有强大免疫抑制功能的长效类糖皮质激素，能够增加信号蛋白IB的基因转录，阻断钙离子载体对单核和其他淋巴细胞起作用，调节多种炎性因子的表达并抑制吞噬细胞向炎症局部移动，从而发挥免疫抑制作用[9]。早在2003年，Willment等[10]发现地塞米松是Dectin-1 mRNA表达的负向调节剂，且仅在24 h时下调Dectin-1 mRNA表达水平。而有关地塞米松对模式识别受体TLR2影响的结果则不尽相同，多数文献报道认为地塞米松显著上调TLR2的表达水平[11]，也有文献称地塞米松对TLR2的表达无明显影响[12]或呈现出抑制性的调节作用[13]。我们的实验结果发现地塞米松单独干预24 h对正常状态下的RAW264.7巨噬细胞Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表达均表现出明显的抑制作用，而地塞米松对TLR2受体的转录和翻译却起上调作用。此外，我们的实验也证实大剂量地塞米松对巨噬细胞具有明显的毒性作用。由此我们推测地塞米松通过抑制巨噬细胞生长，抑制Dectin-1的表达，干扰机体的免疫识别，从而发挥免疫抑制效应。

环磷酰胺是一种烷化剂类的广谱抗肿瘤药，也是目前免疫抑制作用最强、应用最广泛的细胞毒性免疫抑制药。与糖皮质激素不同，环磷酰胺主要杀灭B淋巴细胞，抑制T淋巴细胞的功能，干扰细胞的增殖功能，介导快速的、非选择性的抗原敏感性小淋巴细胞的杀伤，进而发挥强大的免疫抑制作用。早前Yang等[14]发现接受环磷酰胺干预的曲霉菌感染小鼠模型与仅单纯接种曲霉菌的小鼠感染模型相比，Dectin-1表达水平受到抑制，真菌负荷相对增加。栗方等[15]也得出了相似的结论，并同时证明环磷酰胺下调TLR2和TLR4的转录水平。本研究结果显示体外应用环磷酰胺干预细胞，对正常状态巨噬细胞中的Dectin-1和TLR2 mRNA的表达均无明显影响，但是随着环磷酰胺浓度的增加，对细胞生长增殖的抑制功能越明显。我们考虑导致这一结果的原因可能与各自的试验条件不同如给药剂量、药物干预时间以及体内外微环境的不同有关。

环孢素A也能够通过影响天然免疫的模式识别过程发挥免疫抑制作用，但是相关文献报道太少且结果存在争议：我国学者发现皮下注射环孢素A的大鼠TLR2和TLR4 mRNA和蛋白水平和空白组比较明显升高[16]；而Greenblatt等[17]认为Dectin-1是环孢素A作用机制的上游元件，环孢素A对细胞因子IL-10表达的下调作用主要是通过抑制Dectin-1信号通路实现，从而介导对中性粒细胞的抗真菌免疫功能的调控，而与TLR2/Myd88通路无关。环孢素A属于钙调磷酸酶抑制剂，是一种特异性T淋巴细胞功能调节药，能够选择性下调T淋巴细胞相关因子如IL-2、TNF-α的释放，削弱宿主的体液/细胞免疫。本研究结果证明环孢素A能够抑制巨噬细胞生长，对细胞的毒性作用具有剂量依赖性。此外，环孢素单独作用细胞能够下调Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表达水平，抑制Dectin-1和TLR2的转录和翻译。其中大剂量的环孢素对Dectin-1 mRNA表达水平的抑制作用尤为明显，说明环孢素A能同时抑制Dectin-1和TLR2信号通路，从而发挥免疫抑制功能。

霉酚酸酯是器官移植领域常用的免疫抑制剂，主要通过次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的活性，抑制T/B淋巴细胞增殖并减少B淋巴细胞分泌相关抗体发挥强效的、选择性的免疫抑制功能。霉酚酸酯是否能够影响宿主的模式识别受体表达水平介导免疫抑制功能，目前尚不清楚。我们的研究结果发现，霉酚酸酯同环孢素作用相似，也能够下调正常状态细胞Dectin-1、TLR2的转录和翻译，抑制Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的表达，抑制细胞的生长，表现出一定的免疫抑制作用，且这一抑制效应具有明显的浓度依赖性。

综上所述，四种免疫抑制剂均对小鼠RAW264.7巨噬细胞的生长增殖具有抑制作用。而不同免疫抑制剂对天然免疫系统模式识别过程的影响则具有一定的差异性：地塞米松能够下调正常状态下Dectin-1的转录和翻译发挥免疫抑制效应；体外环磷酰胺干预并不影响巨噬细胞Dectin-1和TLR2的转录翻译；霉酚酸酯和环孢素A能够同时下调Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的表达。因此我们认为在模式识别水平，不同免疫抑制剂发挥免疫抑制效应的作用机制也不尽相同，通过选择性调节各自靶点PRRs的表达抑制机体对各种真菌病原体的免疫识别功能。

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[收稿2016-05-09 修回2016-06-07]

(编辑 许四平)

Effects of immunosuppressants on Dectin-1 and TLR2 expression in macrophages

MAOYa-Nan,WANGWen,WANGDong,ZHANGBo.

AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

Objective:To study the effects of dexamethasone,cyclophosphamide,cyclosporin A and mycophenolate mofetil on the expression of Dectin-1 and TLR2 receptor in RAW264.7 cell line.Methods: In vitro culturing RAW264.7 macrophages,the cells were given different doses of dexamethasone and cyclophosphamide,cyclosporin A and mycophenolate mofetilfor 24 h.The influence of different immunosuppresants on cell proliferation was detected by CCK-8 assay.Dectin-1,TLR2 mRNA and protein levels of change were detected with RT-PCR technique and flow cytometry.Results: CCK-8 cell proliferation toxicity experiment results showed that with the increase of the dose of dexamethasone,cyclophosphamide,Cyclosporin A and mycophenolate mofetil,the different degree of inhibition of RAW264.7 cell proliferation in mice can be saw after the intervention of 24 h (P<0.05).After 24 h of dexamethasone stimulation,Dectin-1 mRNA and protein level decreased,TLR2 mRNA and protein levels elevated (P<0.05).However cyclophosphamide had no obvious influence on Dectin-1 and TLR2 (P>0.05).Mycophenolate mofetil and cyclosporin A could both inhibit the expression of Dectin-1 and TLR2 (P<0.05).Conclusion: There are significant differences among the regulatory functions of various immunosupressants on the expression of pattern recognition receptors.Different immunosuppressive agents exert their inhibitory effects on immune recognition process of fungal pathogens not only by selectively regulating their target PRRs expression,but also by inhibiting the growth and proliferation of macrophages.

Immunosuppressant agent;Dectin-1;TLR2;Macrophage

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.010

毛亚男(1988年-)，女，硕士，主要从事感染与免疫方面的研究，E-mail：1035999640@qq.com。

及指导教师：张 波(1966年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事感染免疫与呼吸机方面的研究，E-mail：zhangbohuxi@sina.com。

R563.1 R392.5

A

1000-484X(2017)03-0365-05

①空军总医院呼吸内科,北京100142。