IgG型抗登革病毒NS1抗体介导被动系统性过敏反应的研究①

郭勇晖 朱 伟 王艳芳 丁细霞 陈政良 富 宁

(南方医科大学基础医学院免疫教研室，广州510515)

IgG型抗登革病毒NS1抗体介导被动系统性过敏反应的研究①

郭勇晖 朱 伟②王艳芳②丁细霞②陈政良 富 宁②

(南方医科大学基础医学院免疫教研室，广州510515)

目的：明确登革病毒Ⅰ型(Dengue virus serotype 1,DENV1)非结构蛋白1(Non-structure protein 1， NS1)与其IgG型抗体的免疫复合物(Immune complexes，ICs)能否诱导机体产生被动系统性过敏反应(Passive systmic anaphylaxis，PSA)，为阐明登革出血热与登革休克综合征(DHF/DSS)的发病机制提供依据。方法：从本课题组现有的多株抗NS1单克隆抗体中，筛选能够与纯化NS1结合并形成免疫复合物进而诱导小鼠产生被动系统性过敏反应(PSA)和被动皮肤过敏反应(Passive cutaneous anaphylaxis，PCA)的单抗或单抗组合；并观察体内氯化钆(GdCl3)和血小板活化因子受体(PAFR)拮抗剂CV-3988处理对PSA的影响。结果：用亲和层析纯化的DENV1 NS1，从本室制备的20株IgG型抗DENV1 NS1单抗中仅筛选出2组单抗组合制备免疫复合物(NS1-IgG ICs)能成功诱导小鼠的PCA和PSA反应，而其他抗体或抗体组合并无此反应；用GdCl3抑制单核巨噬细胞或CV-3988阻断PAFR处理可抑制或减轻小鼠PSA反应。结论：DENV1 NS1结合两个IgG型单抗组合的免疫复合物可诱发PSA与PCA，但并非所有的抗NS1单抗或抗体组合与NS1结合都能诱发PSA，推测与识别表位不同有关；初步证明DENV1 NS1-IgG ICs 诱发PSA的主要效应细胞是巨噬细胞，主要效应分子是PAF。

IgG；NS1；免疫复合物；被动系统性过敏反应(PSA)；登革休克综合征；被动皮肤过敏反应(PCA)

已知受到登革病毒感染威胁的全球人群近39亿，每年感染患者达5千万～1亿，重症患者约50万人[1-4]。我国南方近年感染率增高，仅广东省2014年就达45 000例[5]。登革感染的主要临床表现是自限性的登革热(Dengue fever,DF)，其中的重症感染如登革出血热与登革休克综合征(DHF/DSS)约占DF患者的5%～10%[6]，发生率虽低但死亡率高。但重症登革的发病机制尚未完全阐明。目前对致命性的DSS已有大量研究并提出若干可能的原因，如抗体依赖增强效应(ADE)[7]，细胞因子风暴[8]，补体依赖的细胞毒[9]反应等。近年，IgG而不是IgE抗体引发的过敏性休克研究备受关注，我们推测过敏性休克可能是导致DSS原因之一。因此，我们的关注点是非结构蛋白1(NS1)与其IgG型抗体结合形成的免疫复合物是否能够引起休克。因重症登革患者的血清动力学恰恰具备抗NS1的IgG抗体介导过敏休克反应的条件，即血清中含有较高浓度的NS1蛋白及相应的IgG抗体水平[10-12]。鉴于国际上仅有个别实验室具有可感染登革的特殊成年小鼠，本文拟通过小鼠模型明确纯化天然DENV1 NS1蛋白与其IgG型抗体的免疫复合物能否诱导机体产生PSA，并初步揭示PSA反应的主要效应细胞与效应分子，为阐明DHF/DSS的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8～10 周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠，购自南方医科大学实验动物中心。

1.1.2 试剂 DENV1(Hawaii株)由本实验室保存；Vero细胞由武汉病毒所惠赠；胎牛血清(FBS)、MEM培养基和庆大霉素购于美国Life technologies公司；一次性0.22 μm滤器、超滤膜夹购自美国Merck Millipore；CNBr-activated Sepharose 4B购自美国GE公司；预染蛋白相对分子量标准购自美国Thermo Fisher Scientific；ECL 底物购自美国BioRad；GdCl3、PAFR拮抗剂CV-3988购自美国Sigma-Aldrich；20株抗DENV NS1 IgG型单克隆抗体均由本实验室制备[13,14]。其他所用试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 DENV1感染浓缩上清制备 Vero细胞用含10%FBS和50 μg/ml庆大霉素的MEM培养基置37℃培养至细胞密度约80%，PBS洗涤细胞3遍，然后用含DENV1病毒的无血清MEM培养基于34℃感染2 h，去上清并加入含2%FBS的MEM培养基，34℃培养4 d后收获上清，12 000 r/min离心30 min后经0.22 μm滤器过滤，取上清，通过超滤系统浓缩5～10倍(Labscale System，美国Merck Millipore)，即为DENV1感染浓缩上清。

1.2.2 亲和层析纯化DENV1 NS1蛋白 用DENV NS1高亲和力单抗3B1交联溴化氰活化的Sepharose 4B制备亲和层析柱[15]， DENV1浓缩上清以1 ml/min 低速通过亲和柱2次，充分洗涤后，碱洗脱并中和收集DENV1 NS1蛋白。蛋白纯度及免疫反应性用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE及Western blot鉴定；纯化蛋白浓度用BCA法定量。

1.2.3 以DENV1 NS1-IgG ICs构建小鼠PSA模型 IgG型DENV1 NS1抗体以单株抗体(100 μg)或以两株组合(50 μg+50 μg)抗体分别与DENV1 NS1纯化蛋白(10 μg)混合(以生理盐水配成200 μl总体积)，37℃孵育30 min形成免疫复合物(NS1-IgG ICs)，经尾静脉注射BALB/c小鼠，并用数字体温仪(Mode BAT-12,美国 Physitemp)测定攻击后0～90 min内小鼠直肠温度的变化，用于评估过敏性休克的严重程度。

1.2.4 用NS1-IgG ICs构建小鼠PCA模型 以DENV NS1小鼠单抗或抗体组合20 μg与DENV1 NS1 5 μg混合，于37℃孵育30 min形成的免疫复合物直接注射小鼠足垫，5 min后经尾静脉注射200 μl含0.5% 伊文氏兰的生理盐水，5 min后观察小鼠足掌蓝染程度。

1.2.5 GdCl3对NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA的影响 分别以每只小鼠尾静脉注射1 mg(总体积200 μl)GdCl3，以等体积生理盐水为对照，每个实验组3只小鼠，重复2次)，24 h后按1.2.3步骤利用NS1-IgG ICs构建小鼠PSA模型，并观察GdCl3对NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA的影响。

1.2.6 PAF受体(PAFR)拮抗剂对NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA的影响 分别以200 μg CV-3988(含5%乙醇，总体积200 μl 生理盐水)或等体积生理盐水静脉注射小鼠，30 min后观察NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA效果。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS13.0分析，结果中各组间小鼠直肠温变化采用重复测量数据的方差分析。

2 结果

2.1 纯化DENV1 NS1蛋白的纯度及免疫反应性 对获得的纯化DENV1 NS1蛋白进行SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定，上样蛋白分别进行100℃加热10 min或不加热处理，SDS-PAGE结果显示DENV1 NS1蛋白在未加热处理时大小约100 kD，加热变性后约48 kD，可见加热变性处理后形成单体结构，不加热处理的蛋白为二聚体结构，条带位置与预期结果相符(图1A)。 Western blot鉴定结果显示，两种处理后的蛋白条带均可以与DENV1 NS1特异性单抗3B1反应(图1B)，证明所获纯化蛋白具有天然结构。

2.2 NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA 用20株单抗或抗体组合与NS1蛋白制备ICs进行小鼠体内攻击，结果显示：只有5D25+3B1和5D25+3C65这两个抗体组合分别与不同浓度DENV1 NS1蛋白形成各组免疫复合物，分别静脉攻击BALB/c小鼠能诱导PSA反应，结果见图2，可见其PSA反应程度与DENV1 NS1蛋白浓度相关。5D25+3B1的效果略优于5D25+3C65组合。值得注意的是这两个抗体组合均可在体外形成双抗体夹心ELISA，提示该特征有助于抗体Fc段在体内与巨噬细胞表面FcγR结合形成交联(cross-linking)。

图1 纯化DENV1 NS1蛋白的SDS-PAGE及Western blot 鉴定Fig.1 Identification of purified DENV1 NS1 protein by SDS-PAGE and Western blot

图2 NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA模型的建立Fig.2 Establishment of PSA model by challenge with NS1-IgG ICsNote: A.NS1-IgG ICs formed by DENV1 NS1 with mAb 5D25 and 3B1;B.NS1-IgG ICs formed by DENV1 NS1 with mAb 5D25 and 3C65.

图3 NS1-IgG ICs诱导小鼠PCAFig.3 Establishment of PCA model by challenge with NS1-IgG ICs

2.3 NS1-IgG ICs可诱导小鼠PCA 以5D25+3B1和5D25+3C65抗体组合分别与DENV1 NS1蛋白形成免疫复合物，并皮下注射小鼠两足垫，以生理盐水为对照，5 min后给予小鼠静脉注射200 μl含0.5% 伊文氏兰-生理盐水，可见注射NS1-IgG ICs后的小鼠足掌出现明显的蓝染即血浆渗透现象，而另一只注射生理盐水的足掌则无此效应(图3)，证明NS1-IgG ICs可诱导小鼠PCA反应。而其他单抗或单抗组合均无此反应，提示NS1-IgG ICs诱导PSA与PCA是平行的。

2.4 GdCl3处理对NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA的影响 应用GdCl3预处理小鼠24 h后用NS1-IgG(5D25+3B1)ICs触发小鼠PSA反应，结果显示GdCl3处理可以明显抑制甚至完全消除小鼠的PSA反应(图4)。已知GdCl3可以抑制单核巨噬细胞[16]，由此提示单核巨噬细胞是NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA反应的主要效应细胞。

图4 GdCl3对NS1-IgG(5D25+3B1)ICs诱导小鼠PSA的影响Fig.4 Effects of GdCl3 on PSA induced by NS1-IgG(5D25+3B1)ICsNote: **.P<0.01,comparing with control group.

图5 PAFR拮抗剂CV-3988对NS1-IgG(5D25+3B1)ICs诱导小鼠PSA的影响Fig.5 Effects of antagonists CV-3988 on PSA induced by NS1-IgG(5D25+3B1)ICsNote: **.P<0.01,comparing with control group.

2.5 PAF拮抗剂CV-3988对NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA的影响 如图5所示，用PAF拮抗剂CV-3988 处理可以显著减轻NS1-IgG(5D25+3B1)ICs诱导小鼠PSA反应，提示PAF是NS1-IgG ICs诱导小鼠PSA反应的主要效应分子。

3 讨论

本研究拟通过IgG型抗NS1单克隆抗体或抗体组合与NS1抗原形成的免疫复合物从而诱发小鼠被动系统性过敏反应(PSA)，揭示重症登革休克综合症(DSS)可能的发生机制。实验结果证实两个IgG型单克隆抗体组合即5D25+3B1和5D25+3C65可以诱发PSA与被动皮肤过敏反应(PCA)。进而以能引起小鼠肛温显著下降的NSl-IgG(5D25+3B1)免疫复合物(ICs)，建立NS1-IgG ICs触发PSA模型，用GdCl3和PAF拮抗剂CV-3988初步证明此PSA反应的效应细胞是单核巨噬细胞，主要效应分子是PAF。

以往人们多关注再次感染不同血清型登革病毒时的抗体依赖增强作用(Antibody-dependent enhance,ADE)，尤其是登革E蛋白抗体或抗病毒多克隆血清的ADE作用，认为是ADE促进了病毒的大量复制而加重病情[7,17,18]。本研究结果显示IgG型抗NS1抗体结合NS1可以导致被动过敏休克，恰恰临床重症登革热的血清动力学表现具备了存在高水平NS1与抗NS1 IgG型抗体的条件[10-12]，提示NS1-IgG免疫复合物引发过敏性休克是重症登革休克可能的发病机制之一。

我们采用的注射ICs诱导被动过敏休克反应是基于本课题组用36组抗原-抗体反应诱导PSA的前期工作[19],证明提前3 h注射单抗后注射抗原与直接注射ICs效果基本相同，PCA反应也是如此。因此本次直接采用了体外制备NS1-IgG ICs。前期工作曾证实并非所有特异性相同的单克隆抗体或抗体组合都能诱发PSA，而是需要两个不同抗体分子识别抗原分子上的不同表位，或两个单一抗体识别抗原分子上的重复表位，这样其Fc段才有可能与FcγR形成交联进而引发生物学效应。基于前期研究的经验，我们从20株单抗或单抗组合中只筛选到两个抗体组合5D25+3B1和5D25+3C65，成功地诱导出PSA与PCA，其他8株抗体及6个抗体组合均未能成功。5D25、3B1和3C65这三株单抗单独使用时均不能诱导PSA与PCA。它们构成两个组合的另一特点是能够在体外组成两个双抗体夹心ELISA，提示我们在寻找能够诱导PSA抗体组合的时候可将能否形成双抗体夹心ELISA作为初筛标准，我们前期36个抗原-抗体反应体系中19个能在体外形成双抗体夹心ELISA的抗体或抗体组合中有14个能够诱导PSA[19]。与我们制备的多株单抗比较，登革DSS患者血清含针对NS1不同表位的多克隆抗体，只要有足够的IgG抗体与NS1浓度就似乎具备了诱导PSA的基本条件。我们推测DSS发生率极低，除在NS1蛋白高峰期能否具备高水平IgG抗体这个必需条件外，也许与特定表位是否是诱导该抗体反应的优势表位有关。本实验室制备并保存了149株针对不同血清型特异性及交叉反应的登革NS1的单克隆抗体[13,14,20]，有条件在后续工作中继续去鉴定这些抗体与抗体组合并确定有关表位。

至于NS1-IgG ICs引发的PSA是否依赖补体，因暂时没有补体缺陷动物而未能证实，但我们前期工作曾用补体第三成分(C3)敲除小鼠证实用卵黏蛋白(OVM)及其单抗诱导的PSA反应与野生型无区别，即这种IgG介导的PSA是补体非依赖性的[21]。

为明确NS1-IgG ICs诱导PSA的效应细胞与主要效应分子，我们用抑制单核巨噬细胞的经典方法GdCl3处理小鼠，证实巨噬细胞是NS1-IgG ICs诱导PSA的主要效应细胞。我们前期工作曾用抗Mar-1、anti-Gr1抗体、GdCl3、毒性脂质体(Clodronate liposome，氯磷酸盐脂质体)、环磷酰胺分别清除BALB/c与C57BL/6两种小鼠嗜碱粒细胞、中性粒细胞及单核/巨噬细胞或阻断其功能，发现清除嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞等各类血细胞对OVM-IgG 单抗诱导的PSA的发生与严重程度无明显影响，只有GdCl3和毒性脂质体分别清除巨噬细胞才显著抑制PSA反应。为确认该现象是否具有普遍性，我们又用5种不同的抗原-IgG抗体复合物诱导经毒性脂质体处理的小鼠并获得同样结果。证明巨噬细胞是IgG诱导被动过敏途径的主要效应细胞。本研究只用GdCl3处理BALB/c小鼠，其抑制效果极为显著，几乎是完全抑制，这与我们的前期工作相符。

此外，已知登革病毒可在体外刺激单核细胞产生PAF[22]，而PAF受体敲除小鼠或给予PAR受体阻断剂能减轻小鼠感染表现以及降低死亡率[23]。也有报道PAF 在人类 IgG 抗体所介导的过敏反应中发挥关键作用[24]，本研究以 PAF受体拮抗剂 CV-3988 阻断体内PAF的功能，显著减轻了NS1-IgG ICs所诱发的PSA反应，结果说明PAF是NS1-IgG ICs诱发PSA反应的主要效应分子，阻断PAF也可能是治疗重症登革的策略与药物研发思路之一。

当然，重症登革(DHF/DSS)的发生机制是复杂、多因素的，基于我们的149株抗NS1单抗，我们还发现了少数单抗可以结合人和家兔血小板(未发表)。本研究仅是初步提供了认识DSS形成机制的一种可能性，因受限于国内无登革感染成年小鼠模型，尚未能进行体内感染实验以模仿体内NS1及NS1抗体动力学与形成PSA的关系。

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[收稿2016-12-30]

(编辑 倪 鹏)

IgG antibodies against Dengue virus non-structure protein 1 mediate passive systemic anaphylaxis in mice

GUOYong-Hui,ZHUWei,WANGYan-Fang,DINGXi-Xia,CHENZheng-Liang,FUNing.

DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515,China

Objective:To ascertain whether the immune complexes(ICs) formed by Dengue virus 1 non-structure protein 1(DENV1 NS1)and its IgG antibodies could mediate passive systemic anaphylaxis(PSA) and to explain the pathogenesis of Dengue hemorrhagic fever or Dengue shock syndrome(DHF/DSS).Methods: The monoclonal antibodies(mAbs) or mAb cocktails from 20 IgG mAbs of DENV1 NS1 prepared in this lab were screened to initiate PSA and passive cutaneous anaphylaxis(PCA) in mice.Meanwhile,the effects of GdCl3and platelet activating factor(PAF) antagonist CV-3988 on PSA induced by the NS1-IgG ICs were observed.Results: Two groups of monoclonal antibody cocktails with purified NS1 were proved to be capable of provoking PCA and PSA in mice,whereas the other mAbs or mAb cocktails could be not.The murine PSA initiated by NS1-IgG(5D25+3B1) ICs could be significantly inhibited by in vivo treatment with GdCl3or PAF antagonist CV-3988.Conclusion: The NS1-IgG ICs formed with DENV1 NS1 and IgG mAb cocktails can mediate PSA and PCA,but not all of ICs formed by DENV1 NS1 mAbs or mAb cocktails with DENV1 NS1 can induce PSA,indicating that it may be related to the special epitopes of DENV1 NS1.The monocyte/macrophages and PAF may be as major effector cells and the major mediator for PSA induced by NS1-IgG ICs,respectively.

IgG；NS1；Immune complexes；Passive systemic anaphylaxis(PSA)；Dengue shock syndrome；Passive cutaneous anaphylaxis(PCA)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.004

①本文为国家自然科学基金委员会-广东省人民政府联合基金资助项目(U1132002)。

郭勇晖(1984年-)，男，硕士，主管技师，主要从事急性传染病病原微生物诊断及感染机制方面研究，同时就职于南方医科大学珠江医院检验医学部，E-mail:kink1984@163.com。

及指导教师：陈政良(1957年-)，男，博士，教授，主要从事天然免疫及免疫性疾病方面的研究，E-mail：zhlchen@fimmu.com。

R373.3+3

A

1000-484X(2017)03-0338-05

②南方医科大学珠江医院检验医学部，广州 510515。