DAPT调节Treg/Th17细胞免疫平衡抑制动脉粥样硬化①

杨敬宁 张 素 罗羽莎 陈 俊

(湖北医药学院免疫学教研室，十堰442000)

DAPT调节Treg/Th17细胞免疫平衡抑制动脉粥样硬化①

杨敬宁 张 素 罗羽莎 陈 俊②③

(湖北医药学院免疫学教研室，十堰442000)

目的：观察Notch信号抑制剂分泌酶抑制剂(γ-DAPT)对动脉粥样硬化小鼠病理改变及Treg/Th17细胞免疫平衡的影响。方法：将24只ApoE 基因敲除C57BL小鼠随机分为空白组、模型组和DAPT组。空白组用普通饲料饲养，模型组和DAPT组用高脂饲料饲养。饲养5 周后，DAPT组小鼠以100 mg/(kg·d)皮下注射 DAPT(溶于DMSO中)，其余两组皮下注射等量DMSO。5 周后，采用病理染色分析各组小鼠动脉病理改变，ELISA检测血浆中IL-17水平，采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏Treg/Th17细胞比例。结果：HE染色结果显示，模型组有明显粥样斑块形成和泡沫细胞形成，DAPT组动脉病变程度比粥样动脉硬化模型组明显减轻。正常组、模型组和DAPT组各组血浆中IL-17水平分别为(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml；DAPT降低AS小鼠血浆IL-17水平(P<0.05)。空白组、模型组和DAPT组各组小鼠Treg 细胞百分比分别为(3.80± 0.56)%、(2.54± 0.38)%和(4.73± 0.64)%；DAPT降低AS小鼠血浆IL-17水平(P<0.05)。空白组、模型组和DAPT组各组小鼠Th17细胞亚群分别为(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%。结论：DAPT降低AS小鼠血浆IL-17的水平，抑制Th17细胞亚群分化，而促进Treg细胞分化，通过改变Treg/Th17细胞免疫平衡从而减轻动脉粥样硬化。

动脉粥样硬化；Notch 信号；DAPT；流式细胞术

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要病理学基础，是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。越来越多的证据表明AS是慢性炎症性疾病，固有免疫和获得性免疫炎症机制参与了此疾病的发展和发生过程[1,2]。研究发现T细胞失衡在AS致病过程中发挥了重要作用，其中调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)和辅助性T细胞17(Th17)尤为重要。

Notch信号途径决定细胞分化、增殖和凋亡，同样，参与T细胞的分化调控。(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(N-(N-[3,5-difluorophenacetyl]-L-alanyl)-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT)为Notch信号下游分子γ-分泌酶的抑制剂，可抑制Notch 信号通路。本研究探索Notch 通路抑制剂DAPT对AS 病变的影响及对AS 小鼠Treg/Th17平衡的影响，为AS 治疗和预防提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 ApoE基因敲除C57BL 小鼠24 只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF级，雌性，5～6周龄，体重15 g，饲养于湖北医药学院动物中心。

1.1.2 试剂 DAPT购自Selleck公司，离子霉素(Ionomycin,Ion)、佛波酯(Phorbol myristatr,PMA)，莫能霉素(Monesin)自Sigma公司，小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3、IL-17等抗体购自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 建立AS小鼠动物模型 ApoE基因敲除C57BL小鼠共24只，随机分组。空白组使用普通饲料饲养，模型组和DAPT组使用高脂饲料(含2%胆固醇及10%猪油)饲养5周。从第6 周开始，空白组和模型组均接受隔天皮下注射DMSO 140 μl/只；DAPT组接受隔天皮下注射10 mmol/L DAPT 160 μl/只(DMSO 溶解)。注射时长为5周。

1.2.2 IL-17 的检测 ApoE基因敲除C57BL小鼠于第10周采集眼球静脉血，分离血浆于-80℃冰箱保存备用。应用酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组小鼠外周血上清中IL-17的浓度。外周血离心后收集的上清，采用预包被ELISA kit 检测IL-17的表达水平，参照说明书进行具体操作，最后经酶标仪在450 nm处读取吸光度值，并在标准曲线上计算其浓度值。

1.2.3 病理染色分析动脉病理改变 小鼠于第10周麻醉后，显微镜下分离主动脉，将取出的材料放入多聚甲醛4%中固定2～4 h后移至30%蔗糖中4℃冰箱保存过夜。经固定后，常规石蜡包埋，4 μm切片。常规方法行HE染色，于光学显微镜下拍照分析。

1.2.4 脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞FACS检测 取脾脏研磨获得细胞悬液，利用小鼠淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法得到单个核细胞。取1×106单个核细胞用100 μl PBS重悬，加入CD4和CD25抗体，混匀后室温避光孵育30 min，反应后洗涤，再加入1 ml的固定、穿膜剂，混匀后室温避光15 min，反应后洗涤，加入100 μl穿膜剂重悬细胞，再加人20 μl Foxp3抗体，室温避光孵育30 min，洗涤细胞后加入300 μl冷PBS重悬细胞，应用FACS Calibur型流式细胞仪检测。

1.2.5 脾脏Th17细胞FACS检测 取脾脏研磨获得细胞悬液，利用小鼠淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法得到单个核细胞。取1×106单个核细胞悬液，加入离子霉素(1 μg/ml)、和PMA(100 ng/m1)，混匀后37 ℃、5% CO2条件下孵育，1 h后加入莫能霉素(1 μl/ml)继续培养，5 h后离心收集细胞，100 μl PBS重悬，分别加入20 μl 的CD3和CD4抗体，混匀后室温避光孵育30 min，反应后洗涤，再加入200 μl的固定、穿膜剂A，混匀后室温避光15 min，反应后洗涤，加入100 μl固定、穿膜剂B重悬细胞，再加人20 μl IL-17抗体，室温避光孵育30 min，洗涤细胞后加入300 μl冷PBS重悬细胞，应用FACS Calibur型流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 小鼠主动脉形态及病理改变 HE染色结果显示，空白组(图1A)动脉内膜连续完整，模型组(图1B)与空白组相比动脉内膜不规则增厚，AS斑块明显向管腔内突起，周围纤维组织也逐渐增多，并在斑块表面形成纤维帽，具有典型脂质核心，脂质核心区和纤维帽浸润于散在的炎性细胞中，内皮下间隙大量巨噬细胞源性泡沫细胞聚集，泡沫细胞体积大，胞质呈空泡状，动脉中膜平滑肌细胞穿增生并摄取脂质，内膜隆起及变形，粥样斑块形成。DAPT组(图1C)动脉病变程度比粥样动脉硬化模型组明显减轻，动脉内膜没有增厚，亦没有大量泡沫细胞聚集，但血管内皮明显脱落。

2.2 DAPT对动脉粥样硬化小鼠血浆IL-17的影响 为明确干预Notch信号通路是否影响Th17细胞分泌细胞因子IL-17的水平，我们应用ELISA方法检测培养上清中IL-17的水平。正常组、模型组和DAPT组各组血清中IL-17水平见图2，分别为(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml，模型组与正常组相比，血清IL-17水平明显升高(P<0.05)，DAPT组与模型组相比，血清IL-17水平明显降低(P<0.05)。由此可见IL-17参与了AS炎症发生，DAPT抑制Notch信号通路降低AS小鼠血清IL-17的水平。

图1 小鼠主动脉病理形态改变(H&E染色，×200)Fig.1 Pathological changes of aorta in mice(H&E,×200)Note: A.Blank group;B.Model group;C.DAPT group.

图2 各组小鼠IL-17水平Fig.2 Plasma level of IL-17 in each group of miceNote: A.Blank group;B.Model group;C.DAPT group.

2.2 DAPT对动脉粥样硬化小鼠脾脏Treg/Th17细胞平衡的影响 为明确Notch信号通路在动脉粥样硬化小鼠Treg/Th17细胞失衡中的作用，应用流式细胞术检测各组中小鼠脾脏Treg/Th17细胞亚群的变化。结果如图3所示：空白组、模型组和DAPT组小鼠Treg 细胞百分比分别为(3.80± 0.56)%、(2.54± 0.38)%和(4.73± 0.64)%。DAPT组与空白组和模型组相比，Treg细胞百分比明显升高(P<0.05)，说明通过DAPT 抑制Notch 信号通路能够调节动脉粥样硬化小鼠Treg亚群变化。

空白组、模型组和DAPT组各组小鼠Th17细胞亚群分别为(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%，模型组与空白组相比，Th17细胞亚群明显升高(P<0.05)，DAPT组与模型组相比，Th17细胞亚群明显降低(P<0.05)，提示通过DAPT抑制Notch信号通路能够降低动脉粥样硬化小鼠Th17细胞比例。

3 讨论

AS是一种常见慢性、渐进性动脉疾病，尽管对于AS的原因及发生机制有多种学说阐述[3-8]，但并未能真正完全阐明。近来研究表明[1,4]，炎症在AS的脂质条纹的形成、病变到斑块破裂整个过程都起着非常重要作用。在引起炎症的细胞中，主要包括巨噬细胞、肥大细胞和T细胞。其中，T细胞最为关键，调控炎症的主要是Th17细胞亚群和Treg，前者具有促进AS发展的作用，后者则能抑制其他免疫细胞的功能，发挥抑制免疫炎症反应作用[9,10]。

Notch 基因编码一类高度保守的细胞表面受体，通过相邻细胞之间的相互影响决定细胞分化、增殖和凋亡[11]。哺乳动物Notch 受体包括四种(Notch 1-4)，其配体分为两个家族：Jagged 家族(Jagged1,Jagged2)和Delta样家族[12]。当配体与受体胞外区结合后，发生酶切，然后经γ-分泌酶进行组成性酶切，激活相关基因的表达。DAPT为γ-分泌酶抑制剂，能抑制Notch 信号传递。已发现ox-LDL 能显著上调巨噬细胞中Notch1受体的表达，提示Notch 信号通路与动脉粥样硬化有关[13]。研究表明，ox-LDL 通过TLR2、TLR4 活化巨噬细胞，并促进 Notch 配体Jagged1 快速表达，活化巨噬细胞，产生大量的促炎因子[14]。 研究表明Notch 信号参与调控Treg细胞分化和参与调节Treg细胞的增殖[15-19]，但也有研究报道阻断Delta样分子4介导的Notch 信号可促进Treg细胞的产生[20]。由此可见，不同的Notch配体结合不同的受体后转导的Notch 信号产生的生物学效应不同。另一方面，许多研究表明Notch1 激活与人类和小鼠Th17 细胞分化有关，Delta样分子1与Notch 3结合的信号促进Th17 、Th1细胞的分化[21，22]。近来研究表明，人树突状细胞高表达Delta样分子4结合Notch 受体促进Th17 、Th1细胞的分化[23]。

本研究利用ApoE基因敲除C57BL小鼠制备AS模型，结果显示AS小鼠较正常小鼠Treg细胞比例减少(P<0.05)，而AS小鼠血浆IL-17的水平和Th17细胞比例较空白对照组升高(P<0.05)。用DAPT抑制Notch 信号途径干预AS小鼠后，Treg细胞比例增加(P<0.05)，而Th17 细胞比例和血浆IL-17的水平均减少(P<0.05)。上述结果表明，Notch 信号促进Th17 分化，抑制Notch 信号则抑制Th17 分化，这与以前研究报道结果一致[21-23]。同时，DAPT促进了Treg细胞比例增加。 本研究HE染色结果显示，应用DAPT后，C57BL小鼠AS减轻，可能与DAPT降低Th17细胞比例和增加Treg细胞比例有关。

本研究发现AS小鼠IL-17的水平较空白对照组升高，而DAPT可以降低AS小鼠血清IL-17的水平，说明IL-17参与AS发病，这与以前研究结果一致[24，25]。IL-17参与AS的发生发展，是重要损伤因素之一，但同时有研究表明IL-17可有助于粥样硬化斑块稳定[26]，有一定保护作用。由于IL-17是Th17细胞特征性细胞因子之一，Th17细胞是IL-17的主要来源，因此，DAPT降低AS小鼠血浆IL-17的水平可能是其降低Th17细胞比例导致的结果。但是IL-17有多个来源，除了Th17细胞外，还包括γδ T细胞、肥大细胞和中性粒细胞[26]，所以，DAPT降低AS小鼠血浆IL-17的水平可能还有其他通路，有待于进一步研究。

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[收稿2016-10-11 修回2016-11-18]

(编辑 张晓舟)

DAPT regulates Treg/Th17 cells immune balance to inhibit atherosclerosis

YANGJing-Ning，ZHANGSu，LUOYu-Sha,CHENJun.

DepartmentofImmunology,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

Objective:To observe the effect of Notch signal inhibitor DAPT (γ-secretase inhibitor)on the pathological changes of atherosclerosis mice and the immune balance of Treg/Th17.Methods: 24 ApoE knockout C57BL mice were randomly divided into blank group,model group and DAPT group.The blank group were fed with normal diet,the model group and the experimental group were fed with high fat diet.After 5 weeks of feeding,the mice in the experimental group were injected with DAPT[100 mg/(kg·d)，resuspended in DMSO],and the other two groups were injected with the equivalent amount of DMSO.After another 5 weeks,pathological changes of the mice in each group were analyzed by HE staining.ELISA was used to detect the level of IL-17 in plasma,and the proportion of splenic Treg/Th17 cells in each group was detected by flow cytometry.Results: HE staining results showed that the model group had obvious plaque formation and foam cell formation,which showed that the AS model was successfully prepared.The degree of arterial disease in the DAPT group was significantly less than that in the model group.The plasma levels of IL-17 in the blank group,model group and DAPT group were(293.94± 28.59),(454.05± 172.68) and (335.40± 89.57) pg/ml，respectively .The percentages of Treg cells in the blank group,model group and DAPT group were(3.80± 0.56)%,(2.54± 0.38)% and(4.73± 0.64)%,respectively.The Th17 cell subsets of mice in the blank group,model group and DAPT group were (3.46±0.23)%,(4.52±0.85)% and (1.38±0.37)%，respectively .Conclusion: DAPT decreased the plasma level of IL-17 in AS mice,inhibited the differentiation of Th17 cell subsets,and promoted the differentiation of Treg,and reduced the atherosclerosis by changing the Treg/Th17 cells immune balance.

Atherosclerosis;Notch signal;DAPT;Flow cytometry

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.005

①本文受湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB650)和湖北省教育厅科学研究计划(B2015495)资助。

杨敬宁(1971年-)，男，硕士，教授，主要从事心血管免疫的研究，E-mail:yangjjnn@163.com。

R541.4

A

1000-484X(2017)03-0343-04

②湖北医药学院附属东风医院心血管内科，十堰442008。

③通讯作者，E-mail：chenjun0121@126.com。