利培酮微生物限度检查方法的建立

王玉华，沈 岚，赵 静，徐丽玮

（1.上海中医药大学，上海 201203；2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264003）

利培酮微生物限度检查方法的建立

王玉华1,2，沈 岚1，赵 静2，徐丽玮2

（1.上海中医药大学，上海 201203；2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264003）

目的：建立利培酮微生物限度检查方法.方法：按照《中国药典》2015年版四部1105《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》中常规法和培养基稀释法对利培酮进行处理，以5种试验菌的回收率对检验方法的有效性进行验证和确认.结果：采用常规方法对利培酮进行微生物限度检查时，发现枯草芽孢杆菌、白色念珠菌在3次平行试验中的回收率均低于50%，其他3种试验菌回收率都高于50%；培养基稀释法(1∶10的样品稀释液，0.2mL/皿)对5种试验菌的回收率均超过50%.结论：本文建立的培养基稀释法可用于利培酮的微生物限度检查.

利培酮；微生物限度检查；验证

利培酮(risperidone)是由比利时杨森制药公司研制的一种新型抗精神病药物.利培酮具有较好的疗效和发生率很低的锥体外系不良反应，是对精神分裂症阳性和阴性症状均有效的药物.在英国作为非典型抗精神病药上市后，被广泛应用于临床[1].

利培酮作为制剂生产的原料，根据其用途，应进行需氧菌、真菌和酵母菌的测定[2].目前文献资料中没有有关利培酮微生物学限度检测方法的报道，本文根据《中国药典》2015年版四部中微生物限度检查法的有关要求，对利培酮的需氧菌、真菌及酵母菌数的检查方法进行方法学验证，建立适合该药品微生物限度检查的方法，从而保证该药品检验方法的科学性和准确性，进一步保证其质量[3-6].

微生物限度检查一般采取常规法，具有抑菌性的品种抑菌性消除方法有中和法[7]、薄膜过滤法[8]、培养基稀释法[9-11]等.根据利培酮的理化性质[12]采取相应的供试品溶液制备方法.

1 仪器、材料与试药

1.1 仪器

BD720恒温培养箱(Binder)，KB720低温培养箱(Binder)，LMQ.C型压力灭菌器 (新华医疗设备有限公司)，HR40-A2生物安全柜（ESCO），SW-CJ-2FD净化工作台（苏州安泰空气净化有限公司）.

1.2 验证用菌株

铜绿假单胞菌［ATCC9027］、金黄色葡萄球菌［ATCC 6358］、枯草芽孢杆菌［ATCC6633］、白色念珠菌［ATCC10231］、黑曲霉［ATCC16404］均由美国菌种保藏中心提供.

1.3 培养基

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(批号:VM655058435)、沙氏葡萄糖琼脂培养基 (批号:VM657938441)、pH7.0NaCl-蛋白胨缓冲液(批号:VM625982406)均购自MERCK.

1.4 药品

利培酮，浙江华海药业股份有限公司（批号：5341-14-001M、5341-14-002M、5341-14-003M.）

2 实验准备

按照《中国药典》2015版四部1105《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》进行.

2.1 供试品溶液的制备

取供试品10g，加入20ml二甲基亚砜，制成混悬液，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试品溶液.

2.2 菌液制备

取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液；

取黑曲霉孢子悬液，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液.

3 细菌、霉菌和酵母菌检查方法学验证试验

3.1 可接受标准

进行3次独立的平行验证，分别计算菌回收率，菌回收率应在50%～200%范围内.

3.2 试验组

①常规法:取1:10供试品溶液1ml和菌液1ml注入平皿中，再注入培养基，混匀，每个菌株制备2个平皿.结果见表1.

②培养基稀释法：取1:10供试品溶液0.2ml和菌液1ml注入平皿中，再注入培养基，混匀，每个菌株制备2个平皿.结果见表2.

需氧菌在30～35℃培养3天，霉菌和酵母菌在20～25℃培养5天，计数取平均值.

3.2 菌液组

测定试验菌液每毫升中含有的菌落数.

3.3 供试品对照组

按试验组的方法，不加菌液，测定供试品本底菌数.

3.4 稀释剂对照组

按照供试品溶液制备方法，不加入供试品，取稀释液与菌液混合液，分别计数，测定菌落数，结果见表1.

3.5 回收率计算

试验组菌回收率=(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%；

稀释剂组菌回收率=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%.

表1 常规法-各菌回收率(1mL/皿)

表2 培养基稀释法-各菌的回收率(0.2mL/皿)

4 结果与讨论

4.1 常规注皿法（1ml/皿）验证结果

按照常规注皿法对3批次样品进行细菌、霉菌和酵母菌计数验证，结果见表1常规法-各菌回收率(1mL/皿)，验证结果表明稀释剂回收率均在50%以上，说明稀释剂二甲基亚砜对实验过程没有影响，可以用于样品制备；试验组菌回收率中，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均在69～145%范围内，说明供试品对这三种菌没有抑菌性，枯草芽孢杆菌和白色念珠菌菌回收率低于50%，供试品对这两种菌有抑菌性.采用培养基稀释法（0.2ml/皿）对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌进行再验证.

4.2 培养基稀释法（0.2ml/皿）验证结果

按照培养基稀释法对三批次样品进行重新验证，两种菌的回收率结果见表2培养基稀释法-各菌的回收率(0.2mL/皿)，表明采用培养基稀释法(0.2ml/皿) 检查时，通过降低每个皿中药物浓度，而降低供试品的抑菌作用，使枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的回收率均超过50%.验证结果表明，采用培养基稀释法可对利培酮的细菌、真菌及酵母菌进行限度检查.

5 结论

本品按照2015年版《中国药典》四部的要求进行验证，研究结果表明采用培养基稀释法可以有效的消除供试品的抑菌效果，5种试验菌的回收率均大于50%.

·利培酮微生物检验样品制备方法

取供试品10g，加入20ml二甲基亚砜，制成混悬液，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试品溶液.

·细菌、霉菌和酵母菌计数方法

取1:10供试液1ml等量分注于5个平皿中，每个平皿0.2ml，注入培养基混匀，培养计数.

〔1〕张华,王翔,等.注射用利培酮微球的制备和体外性质评价［J］.中国新药杂志2013,22(20):2423-2430.

〔2〕国家药典委员会.中国药典:四部[S].北京：中国医药科技出版社,2015．140-149.

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〔4〕钟长鸣,陈希,吴燕红.微生物限度检查和无菌检查方法验证中存在问题［J］.中国药品标准,2011,11（1）:12-13.

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2016-12-19