肠道病毒EV71手足口病病原学及免疫功能改变研究现状

王宇婧 程邦宁

肠道病毒EV71手足口病病原学及免疫功能改变研究现状

王宇婧 程邦宁★

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是以手、足、口多发疱疹为主要特征的一类自限性疾病，5岁以下儿童多发，是由多种肠道病毒引起的儿童常见的急性传染性疾病。肠道病毒EV71是手足口病主要病原体，具有噬神经性，可引起患儿神经症状甚至死亡。本文将对EV71病原学特征、发病机制、感染后机体免疫功能改变进行讨论，以便更加深入了解EV71特征，为手足口病的防治提供依据。

手足口病；肠道病毒EV71；体液免疫；细胞免疫

手 足 口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是儿童常见传染性疾病，以手、足、口多发疱疹为主要特征，是一类自限性疾病，由多种肠道病毒引起的全球儿童常见的急性传染性疾病［1］，5岁以下儿童多发。多由肠道病毒属的柯萨奇病毒A组（coxsackievirus，CoxA）16型，人肠道病毒（enterovi⁃rus，EV）71型引起。HFMD已经成为世界性疾病，目前已经在全球范围内造成多次大规模爆发流行，引起全世界的广泛关注。EV71是导致HFMD的主要病原体［2］，其发病率呈逐年增加的趋势。重症病例主要由EV71引起，重症患儿可以出现神经症状，包括脑炎、脑膜脑炎、脑脊髓炎、急性迟缓性麻痹甚至死亡。本文以EV71为代表对HFMD在病原学特征、发病机制、感染后机体免疫功能改变等方面进行综述，通过对HFMD的进一步研究以达到及早治疗、防止病情进展、减少后遗症的目的。

1 EV71病原学特征

EV71病毒无包膜，是属于小RNA病毒科肠道病毒属的单正链RNA病毒［3］，其5′端与含有VPg蛋白共价连接，3′端为多聚腺苷酸尾，5′⁃非编码区长度为745个核苷酸呈高度结构化包含内部核糖体结合位点（internal ribosomal entry site，IRES），IRES保证RNA合成完整的三叶草样结构并且对病毒mRNA的转运方向起决定作用。三叶草样结构功能具有多样性，作为顺式作用元件与病毒和细胞蛋白相互作用形成核糖核蛋白复合物。40S亚基的核糖体识别特定序列时，翻译开始进行［4］。有研究表明多种蛋白质与小RNA病毒5′端非翻译区作用，参与病毒RNA复制或者IRES反应。上游元件结合蛋白（far upstream ele⁃ment binding protein，FBP1）是一种反式作用因子，通过结合实验，能绘制出EV71 IRES内负责FBP1结合的RNA决定物并且绘制出此反应中包括的蛋白质结构域。在EV71感染时，病毒复制的细胞胞质中核蛋白FBP1含量增高，表明FBP1在EV71复制过程中作为正调节蛋白与EV71中IRES结合［5］。

EV71基因组的5′⁃非编码区（5′⁃untranslated region，5′⁃UTR）和3′⁃非编码区（3′⁃untranslated re⁃gion，3′⁃UTR）构成了仅有的一个开放阅读框（open reading frame，ORF），约占整个基因组的90%，该ORF编码一个多聚蛋白，在病毒自身合成的蛋白酶作用下多聚蛋白被水解成前体蛋白P1、P2和P3，而P1可继续被水解成VP1⁃VP4 4种衣壳蛋白，P2和P3可分别水解成2A⁃C和3A⁃D 7种非结构蛋白［6］。VP4位于病毒颗粒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，其余3种衣壳蛋白均暴露于病毒颗粒表面，因而决定病毒抗原性质的抗原表位主要位于VP1⁃VP3上，EV71重要的中和抗体识别位点由VP1和VP3组成的BC环以及由VP2组成的EF环构成［7］。Ku Z等用3种不同的单克隆抗体与EV71结合，结果显示3种单克隆抗体均识别并结合EV71 VP1区GH环［8］。EV71病毒与其他肠道病毒的差异主要表现在VP1区，因此VP1区结构差异可能是导致EV71具有较强致病性的原因之一。VP1区含有重要的中和抗体识别位点，该区基因变异状况可作为HFMD疫苗研制的靶点［9］。病毒核衣壳蛋白的变异改变病毒致病性，可以此为研究目标分析不同患儿基因型差异与病情的相关性，为疾病的防治提供依据。

2 EV71感染发病机制

HFMD的发病机制目前尚未明确。病毒与易感细胞表面受体结合后可启动病毒感染。细胞受体在决定细胞、组织、种属嗜性和病毒的致病性方面起到重要作用。病毒感染细胞和病毒在细胞之间传播依靠的是不同的细胞表面分子。在感染的组织中，细胞之间的传播在病毒发病机制中占重要作用。当病毒入侵机体后，以许多组织为目标引起胃肠道、心血管、呼吸道和中枢系统疾病。病毒结合到细胞表面受体后感染细胞，细胞受体被认为在发病机理以及组织噬性中具有决定性［4］。B类清道夫受体2（scavenger receptor class B，member2，SCARB2）和P⁃选择素糖蛋白配体⁃1（P⁃selectin glycoproteinlig and 1，PSGL⁃1）被认为是EV71受体［10⁃11］。

SCARB2广泛表达于包括中枢神经系统在内的各种器官和组织中［12］，主要分布于内涵体与溶酶体上，Yamayoshi等［11］对EV71不易感的鼠L929细胞转染EV71高度易感的RD细胞基因组DNA后，筛选出单克隆细胞系Ltr051和Ltr246，Ltr051对EV71的感染效率类似于RD细胞，属于高度易感，Ltr246相比于Ltr051感染效率低；进一步研究发现Ltr051细胞系携带人SCARB2基因。表达SCARB2的L929细胞，对检测的EV71病毒均高度易感。Yamayoshi等［13］通过比较发现人SCARB2（hSCARB2）与鼠SCARB2（mSCARB2）有85.8%的氨基酸相同，相似性达99.9%，但表达hSCARB2的L929细胞，对于EV71的易感性却远高于表达mSCARB2的L929细胞，进一步研究发现hSCARB2第142～204位氨基酸在促进病毒颗粒与细胞的结合及EV71的易感性中都发挥重要作用。EV71通过位于第172位谷氨酰胺残基周围的VP1区与SCARB2结合［14］，SCARB2的第4个外显子在与EV71的VP1蛋白反应中起重要作用。研究还发现位于衣壳蛋白组成的EF环壁上的氨基酸，对病毒结合SCARB2及EV71病毒感染力具有重要意义［13］。

SCARB2广泛表达于各种细胞表面，而PSGL⁃1主要表达在髓系、淋巴系和树突状细胞表达，调节白细胞与选择素之间的反应，因此在促炎反应中起重要作用。Nishimura等［15］研究发现EV71依赖于硫酸化的酪氨酸基团结合到PSGL⁃1的N端。他们同时还发现病毒衣壳蛋白第145位氨基酸残基（VP1⁃145）决定了EV71是否与PSGL⁃1结合，通过影响病毒表面临近的赖氨酸残基（VP1⁃244）的定位发挥作用。据此推测VP1⁃145通过将VP1⁃244带正电荷的赖氨酸链转变为带负电荷而控制病毒的结合。这些发现为病毒受体反应和EV71结合PSGL⁃1表达的白细胞的研究提供了前景［16］。

小肠道RNA病毒对在固有免疫抗病毒反应中起重要作用的干扰素IFNs很敏感，EV71可以通过血脑屏障进入中枢神经系统或者通过轴突从外周转运至中枢，中枢神经系统固有免疫表达的模式识别受体（toll⁃like receptors，TLRs），胞质视黄酸诱导基因1（retinoic acid inducible gene⁃1，RIG⁃1）和黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation associated gene5，MDA⁃5）可监视病毒核酸并且启动宿主抗病毒反应。MDA⁃5是RNA活化I型IFN表达的关键分子［17］。EV71通过RIG⁃1和TLR3调节抑制I型IFN反应，从而抑制机体免疫反应。肠道病毒可逃避宿主免疫系统防御到达中枢神经系统，穿过血脑屏障通过血流传播至中枢，感染白细胞和神经细胞，神经系统的入侵被认为是发生在血脑屏障被破坏或者轴突退化的情况之下［18］。某些小RNA也参与到病毒生命周期的复制和翻译，研究发现小分子RNA（miRNA）在病毒和宿主复杂的网络式反应中起到重要作用，能够调节转录后表达功能。miRNA的表达具有组织依赖性并且大量的同种miRNA可以成为该种miRNA是否在组织中起作用的依据［19］。对EV71发病机制进行深入研究，通过有效阻断病毒与相应EV71受体结合而抑制病毒感染。同时通过对免疫抑制与免疫促进相关分子及其作用机制的研究，可从分子层面对病毒诱导机体发挥的免疫应答进行干预，以此为靶点，对病毒感染进行干预，减少患儿发病。

3 EV71感染的免疫调节

人类是唯一已知的HFMD相关肠道病毒感染的宿主。病毒入侵机体后机体体液免疫系统和细胞免疫系统启动免疫应答发挥免疫防御和抗病毒作用。B细胞被抗原刺激后活化为浆细胞，浆细胞分泌免疫球蛋白发挥抗病毒效应。抗原刺激T细胞后，增殖分化为效应T细胞，在细胞因子的协同作用下发挥细胞免疫功能。

3.1 体液免疫在EV71感染中的作用

孙裕平等［20］对EV71感染为主的HFMD患儿体液免疫功能研究显示重症组和轻症组患儿血清IgA、IgG含量与健康儿童无显著差异，而IgM明显高于健康儿童并随着病情加重而升高，治疗后IgM含量明显下降。重症组和轻症组患儿补体C3、C4含量明显低于健康儿童，随着病情的加重而降低。可能因为IgM是感染早期产生的免疫球蛋白，病毒感染初始阶段B细胞被激活分化为浆细胞产生IgM发挥抗病毒免疫作用保护机体，并且随着病情的进展而产生更多的抗体，经过治疗后抗体与病毒结合被清除而好转。C3、C4作为重要的补体成分参与机体免疫应答，通过多个补体激活途径参与调理吞噬靶细胞、促进炎症反应以及清除免疫复合物而被消耗，所以会随着病情的加重含量降低。说明可根据免疫球蛋白和补体含量判断患儿病情进展及转归为临床治疗提供依据。

3.2 细胞免疫及细胞因子在EV71感染中的作用

研究表明抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）处理抗原片段后激活NK细胞和Tc细胞，通过分泌颗粒酶穿孔素直接杀伤靶细胞。Th细胞作为辅助细胞分泌细胞因子促进体液免疫系统发挥作用。彭宏君等［21］研究显示EV71感染树突状细胞（dendritic cells，DCs）后感染组DCs分泌的TNF⁃α、IL⁃1α、IL⁃6和IL⁃12含量明显高于对照组且TNF⁃α刺激后的DCs能够强烈刺激同种异体T淋巴细胞增殖。表明EV71能够刺激机体免疫细胞发挥免疫应答作用。EV71可促进NK细胞、T细胞凋亡，T细胞、NK细胞比例降低对机体免疫反应产生抑制作用，而随着病情加重比例不断下降［22］。提示患儿病情进展进入重症期时，细胞免疫进一步受损，B细胞介导的体液免疫可能起更大作用，由此引发的抗体和炎性因子会大量增加。疾病的严重程度与细胞因子的水平有关，表明细胞因子的释放可以导致HFMD患儿的免疫损伤［23］。细胞因子可促进炎性细胞渗出，吸引中性粒细胞和单核巨噬细胞迁移至炎症灶，增强免疫细胞的吞噬杀伤功能，还可刺激白细胞和内皮细胞释放炎性介质导致组织损伤，加重病情发展。IFN⁃γ、IL⁃13等细胞因子能增加肺血管通透性，加重肺毛细血管渗漏，可能参与导致肺水肿，促炎因子TNF⁃α、IL⁃2、IL⁃6及抗炎因子IL⁃10在重症HFMD患儿体内均高于普通患儿［24］，表明病毒在机体内引起严重的应激和全身炎症反应，机体内存在复杂的炎症抑制和炎症亢进状态。一个细胞因子的激活可引起连锁反应激活一系列细胞因子。近年陆续报告EV71感染患者血液和脑脊液IL⁃10、IL⁃13、IFN⁃γ、IFN⁃γ诱导蛋白⁃10（inducible protein 10，IP⁃10）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP⁃1）、IFN⁃γ诱导单核因子（monocyte interferon inducing factor，MIG）、IL⁃1受体拮抗剂和粒细胞集落刺激因子（colony stimu⁃lating factor，G⁃CSF）等增高，并与EV71疾病严重程度相关［25⁃26］，说明由IL⁃6、IL⁃1β、和TNF⁃α等介导的急性期蛋白和趋化因子激活可能会导致病毒感染后炎症加重和病理变化。这些研究发现有助于理解免疫细胞及其分泌的细胞因子在HFMD发病中的作用，说明细胞因子可能参与HFMD疾病进展过程，可作为患儿疾病进展的监测指标。

动态监测患儿体内免疫球蛋白、免疫细胞及细胞因子含量可有效反应机体免疫功能状况，有效掌握患儿病情变化，作为临床治疗和预后的指导。

4 小结

目前还没有治疗HFMD的特效药，临床上只能对症处理，进一步研究HFMD的病原特征、发病机制及病毒介导的免疫功能改变对于评价预后风险就显得更加重要。通过对HFMD病原学的进一步分析和研究，揭示病毒生命周期中起关键作用的分子，以参与病毒生命周期复制和翻译的分子为靶点，对病毒感染进行控制，防止病毒持续感染导致病程迁延；通过对发病机制的进一步研究可有效阻断病毒与细胞表面分子的相互作用，减少患儿发病率和死亡率，减少后遗症提高患儿生存质量，有助于HFMD的进一步防治；通过对患儿免疫功能的监测分析在疾病过程中免疫细胞和免疫活性物质在病情进展中的作用分析患儿病情及预后，有助于辅助临床诊断和治疗。

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Research into the etiology and alterations in immunological function of hand, foot and mouth disease caused by Enterovirus 71

WANG Yujing,CHENG Bangning
(Pediatric Clinical College of Anhui Medical University(Anhui Province Children’s Hospital),Hefei,Anhui, China,230051)

Hand,foot,and mouth disease(HFMD)is a self⁃limited disease characterized by multiple herpes of the hand,foot,and mouth,and caused by multiple enteroviruses in children under 5 years old. Enterovirus 71（EV71）is the major pathogen of HFMD,that can cause neurological manifestations and even death due to its neuronal apoptosis function.The purpose of this review is to summarize recent discoveries regarding the pathogen,etiopathogenesis,EV71⁃derived alterations in immunological function,and to provide guidance on preventing and curing HFMD.

Hand,foot and mouth disease;Enterovirus 71;Humoral immunity;Cellular immunity

安徽省卫生和计划生育委员会科研项目（14FR017）

安徽医科大学儿科临床学院（安徽省儿童医院），安徽，合肥230051

★通讯作者：程邦宁，E⁃mail：pcbncbn@126.com