血浆甲基化Septin9基因：一个有潜力的结直肠癌早期筛查标志物

陈纪飞 戴盛明

血浆甲基化Septin9基因：一个有潜力的结直肠癌早期筛查标志物

陈纪飞 戴盛明★

Septin是一类进化上高度保守的细胞骨架蛋白基因家族，具有GTP酶（guanosine triphos⁃phatase，GTPase）活性。家族内的Septin9基因参与细胞分裂、胞吐作用、细胞极性、细胞迁徙、DNA修复等多种生理活动。近年，Septin9基因与肿瘤发生发展中的关系受到广泛关注，甲基化的Septin9基因（methylated Septin9 gene，mSEPT9）被证实为结直肠癌（colorectal cancer，CRC）重要的表观遗传学改变。本文综述了目前常见的几种Septin9基因甲基化检测方法及其对不同种类样本的检测状况，探讨了其在结肠癌早期筛查中的潜在应用价值。

Septin9；甲基化；结肠癌；早期筛查

2013年全世界有100万新诊断的结直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者［1］，约60万患者死于CRC，其主要原因是早期临床症状不明显，大多数患者确诊时已属中晚期，CRC的筛查率亟待提高［2］。目前最常用的CRC筛查手段为结肠镜和粪便潜血实验/粪便免疫化学检测［3］，这两种检测方法相对有效，作为早期的筛查手段，其可以显著降低CRC的死亡率［4⁃5］；但利用率都不高［6］，主要是因为患者对结肠镜的花费和肠道准备的不依从，以及粪便潜血实验的干扰因素多、特异性较低等。为改善相对低的筛查率，肿瘤特异性DNA的基因学及表观遗传学检测受到关注，其对应的样本为粪便、血清或血浆，侵袭性较低，依从性较高［2，7⁃8］。

哺乳动物正常细胞中大约60%编码基因中的CpG岛（CpG islands，CGI）不会甲基化，然而在人类几乎所有类型的癌症中，都存在相关基因的异常甲基化，并引起下游基因的异常表达［9⁃11］，其中有些具有明显的特异性，如CRC中甲基化的Septin9基因（methylated Septin9 gene，mSEPT9）［12⁃13］等。有研究者通过对比正常结肠上皮与CRC组织样本的相关候选生物标志物，发现超过90%的癌组织存在Septin9基因的异常甲基化［14］。本文以mSEPT9在CRC的高特异性为切入点，通过对比几种目前应用较广泛的基因甲基化检测方法以及不同种类样本之间mSEPT9的检出差异，寻找一种依从性好、筛查比率高的CRC早期筛查诊断方法，即血浆甲基化Septin9基因检测方法。

1 Septin9基因简介

Septin9基因最早发现于正混合系白血病基因（mixed lineage leukemia，MLL）的融合产物中［15］，随后发现在散发性的卵巢癌中高频缺失［16］，而在乳腺癌中却高表达［17］，从而推测该基因在癌症中既可作为癌基因，也可作为抑癌基因。Septin9基因由219 kb组成，包含大量的CGI，存在18种不同的转录形式，编码15种异构体，编码与细胞微丝结构及细胞骨架相关的三磷酸鸟苷结合蛋白［18⁃21］。该基因在人体中广泛表达且存在明显的组织表达特异性［22］；不过，由于其表达调控机制极其复杂，至今未能完全了解。

Wasserkort等［23］利用激光捕获显微切割获取了正常的结直肠组织细胞、结直肠腺瘤细胞以及CRC组织的上皮和基质细胞，随后用亚硫酸氢直接测序法，对该基因内、外的4个CGI共8个扩增子（amplicon，Amp）的甲基化状况分别进行了检测及对比分析，其中CGI3又包含Amp 4～7。结果发现，肿瘤组织与正常组织的甲基化差异高达80%，且这种甲基化主要发生于CGI3的Amp5内，这与最近在欧洲应用于临床的 Epi proColon®test（mSeptin9检测试剂盒）所选择的位点一致，且甲基化差异由正常到腺瘤再到CRC阶段有逐步增高的趋势。

2 mSETP9的检测方法

DNA甲基化的检测手段繁多，总的来说，可以根据样本预处理不同分为3大类，分别为酶消化法、亲和富集法、重亚硫酸盐转化法［24］。目前针对于CRC样本的mSETP9检测主要为重亚硫酸盐转化法，其中又以Methllight［25］，改良Methllight［26］方法多见。此外，还有甲基化敏感高分辨率溶解曲线［27］（methylation⁃sensitive high resolution melting，MS⁃HRM），新兴的甲基化特异性PCR联合高压液相色谱［28⁃29］（methylation⁃specific PCR⁃denaturing high performance liquid chromatography，MSP⁃DH⁃PLC）及辅助依赖性链式反应［12］（help⁃dependent chain reaction，HDCR）等方法。

Methllight法即在重亚硫酸盐处理待测DNA片段后，利用特异性实时定量PCR反应进行扩增，以识别完全甲基化的序列，具有敏感度高、模板DNA用量少等特点。改良Methllight法则在原有基础上改用水解探针并增加了一组封闭寡核苷酸以提高分析敏感性。MS⁃HRM不需要荧光探针，其直接分析引物侧翼序列的所有甲基化位点，相对简单，成本较低，有一定优势，但准确性有待提高。MSP⁃DHPLC是最近在国内用于基因突变及甲基化检测的一种方法，测试程序较易，敏感性和特异性较高。HDCR法不需要重亚硫酸盐转化，但链式反应中需要特殊设计的辅助性寡核苷酸参与。总之，mSEPT9检测方法较多且还在不断的探索和发展中，目前较为成熟的是Methllight法及依据此法开发的Epi proColon®test试剂盒，其他的方法在文献报道中虽也显示出巨大的潜力，但目前仍然处在研究阶段，需要大量的前瞻性研究数据的支持。

3 不同种类CRC样本mSETP9的检测

3.1 组织样本

关于组织样本mSETP9检测的相关文献较少，但具有很高的敏感性。其分析敏感性高达88.4%，特异性为93.5%［30］。由于该样本取样的特殊性，使其在应用时存在依从性差的缺点，且费用相对于病理及潜血试验更高；目前主要用于其他种类样本mSETP9检测的敏感性验证，在大规模前瞻性研究及未来可能的CRC早期筛查中可能较难应用。

3.2 血浆样本

血浆mSETP9检测作为一种高特异性、低侵袭性的CRC早期检测方法，因其简单、快速、灵敏等特性，在CRC早期筛查中成为热门，但其诊断敏感性在不同检测方法中存在一定差异（表1）。

表1 不同方法间血浆mSETP9检测的敏感性特异性比较Table 1 Comparison of clinical sensitivity and specificity among different plasma mSETP9 detection methods

CRC的发生与环境因素高度相关［29］，中国人群CRC患者mSEPT9的甲基化状况是否与国外文献报道一致？国外已应用于临床的血清mSEPT9检测试剂盒是否适用于中国人群？Su等用MSP⁃DHPLC研究发现，SEPT9基因在中国人群CRC患者中也存在高度甲基化［30］。He等用Methllight法对182例中国人群CRC患者血浆mSETP9进行检测，其分析敏感性为75%［31］。而另有报道指出［13，32⁃33］，应用Methllight的一种检测方法（the ab⁃bott realtime mS9 colorectal cancer assay system）对韩国CRC患者进行mSETP9检测时，发现分析敏感性仅36.6%；虽具有90.6%的高特异性［34］，但仍与我国以及欧美国家应用Methllight法得到的50%～90%分析敏感性相差很大。结果提示septin9的甲基化模式可能存在一定的种族差异性，需要进一步探索。

3.3 粪便样本

CRC患者的粪便中含有脱落的正常结直肠上皮细胞、结直肠癌组织脱落的癌细胞及游离的DNA，加之肠道的碱性环境，理论上由粪便样本提取的DNA与血浆样本相比，应具有更高的含量和质量。因此，粪便样本mSETP9的检测可能具有较高的敏感性。赵慧霞等应用多重置换扩增结合巢式甲基化特异性PCR［35］及nMSP结合DHPLC［36］的方法分别检测了126例和87例CRC患者粪便mSEPT9的甲基化水平，其分析敏感性达到82%～85%，特异性92%～100%。而Carmona等［37］应用GoldenGate基因分型芯片的方法对87例CRC患者粪便样本中的5种标志物（AGTR1，WNT2，SLIT2，VIM和SEPT9）进行了检测，前三者敏感性达到了78%，相比之下，mSETP9却只有20%。粪便样本的mSETP9检测可能具有很好的特异性及敏感性，但是不同方法间的差异较大，仍然有较多的技术问题需要解决。

4 mSETP9检测在结直肠癌筛查中的应用

Septin9基因5’端调控区CpG岛的甲基化与结直肠癌高度相关，高甲基化发生率在90%以上，相比于正常的癌旁或结肠组织有明显统计学差异，具有较高的特异性，已成为结直肠癌的早期诊断分子标志之一。国内外学者通过不同的检测手段对CRC患者外周血游离DNA进行的mSETP9检测，在CRC诊断上获得了较为一致的高敏感性和特异性，并且现今在欧洲也有基于Methllight法的血清mSEPT9检测试剂盒Epi proColon上市。在超过3 000份的受检血浆样本中，CRC检出率为60%～70%［32，38］。2010年Digestive DiseaseWeek conference发布了对接近8 000名无症状患者血浆mSETP9检测的前瞻性研究结果，显示mSEPT9检测可以检出 67%的 CRC患者，假阳性率为11%［39］。在对该项检测相对于现有筛查项目的性价比（Cost⁃effectiveness）进行对比时［40］，发现尽管该项检测的花费要高于现有筛查项目，但却可以显著提高早期筛查人口的比例［41］，mSEPT9检测作为早期筛查项目显示出了巨大的临床应用价值。

最近Ahlquist［33］等发现，CRC患者粪便中非septin9 DNA分子标志物（Methylated BMP3，NDRG4，vimentin，TFPI2，mutant KRAS）对临床前患者的检测敏感性较血浆mSETP9的检测的敏感性更高，并指出，在进展期腺瘤及早期的CRC筛查检测中，血浆mSETP9缺乏相对高的敏感性。Church等［42］发表的文章中同样也指出此点。这使得与现有的CRC筛查策略相比，血浆mSETP9的检测在临床前患者筛查中的应用就明显处于性价比劣势［24］。

5 小结

如何将mSETP9这一高特异性的CRC表观遗传改变应用于临床，又如何优化其检测技术、提高其敏感性，成为学者们思考的主要问题。与此同时，也有相关文献指出［13，25⁃26，38］，在有远处转移及预后较差的CRC患者中，血浆mSETP9检测具有更高的阳性率，且mSETP9阳性的患者无病生存率也明显低于阴性患者，CRC患者根治术前mSETP9阳性的患者其复发的几率也明显高于阴性者。在未来，血浆mSETP9检测不仅有可能显著提高CRC患者早期筛查率，而且可能在该病的预后评价、随访、根治术后复发风险评估中也占有一席之地。

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Methylated plasma Septin9 gene:a potential marker in colorectal cancer screening

CHEN Jifei,DAI Shengming★
（Liuzhou Key Laboratory of Tumor Diseases and Prevention,Clinical Laboratory,Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Liuzhou,Guangxi,China,545005）

Septin belongs to a highly conserved cytoskeletal protein gene family,which has guanosi⁃netriphosphatase(GTPase)activity.As one of the family members,Septin9 is involved in cell division,exocyto⁃sis,polarity,migration,DNA repair,and other physiological activities.In recent years,the relationship between the Septin9 gene and tumor development has received extensive attention.Methylation of the Septin9 gene (mSEPT9)was confirmed to be an important epigenetic change in colorectal cancer(CRC).In this study,some mSEPT9 detection methods and conditions for detecting mSEPT9 in a variety of sample types are summarized, and the potential application value of mSEPT9 in CRC screening are discussed.

Septin9;Methylation;Colorectal cancer(CRC);Early screening

广西医科大学第四附属医院医学检验科，柳州市肿瘤疾病与防治重点实验室，广西，柳州545005

★通讯作者：戴盛明，E⁃mail：daishm@sina.com