体外诊断试剂质量评价与标准物质溯源

付岳 高旭年 黄杰

体外诊断试剂质量评价与标准物质溯源

付岳1高旭年2黄杰3★

体外诊断试剂标准物质是实现量值溯源、保证检测数据和结果准确一致的重要材料。自上世纪80年代以来，国内实验室在体外诊断试剂标准物质的研制方面做了大量的工作。本文简要介绍了目前国内研制的体外诊断标准物质及其研制中所采用的主要形式：以参考方法、参考系统和标准物质为基础的计量学溯源体系；以多中心合作标定、一致化或类似一致化的溯源体系，并针对两种溯源体系的差别进行了阐述。

体外诊断试剂； 标准物质； 量值溯源

近年来，我国体外诊断试剂（in vitro diagnos⁃tics，IVD）市场规模增长迅速。针对纷杂的产品市场，为保证疾病的有效预防、诊断和治疗监测，相应IVD产品的质量评价和监管也日趋重要。而体外诊断试剂检验结果的准确性、不同厂家同类产品检验结果的一致性是IVD产品质量的重要议题。IVD产品的质量评价一般还需要考虑与产品性能密切相关的准确度、特异性、重复性、检测限等指标。

实现检验结果准确性和可比性的重要手段是保证检验检测的标准化和一致化，标准化的基础是建立参考系统，包括参考方法、标准物质和参考实验室等；一致化的基础是在充分评估技术的原理、影响因素，分析不同技术检测同一靶标的差异，达成检测结果可比的共识。标准化和一致化主要差别体现在量值溯源的方式。标准化的量值溯源方式是追求量值溯源至国际单位、参考方法、标准物质等，一致化的溯源方式则是溯源至经过认可的方法、参考物质。在完整的溯源、量值传递和校正过程中，体外诊断试剂标准物质是实现检验数据和结果准确一致的主要工具，也是保证量值有效传递的计量实物标准［1］。同样，在检测结果一致化过程中，经过认可的方法和/或参考物质也发挥了重要的传导作用。通过标准物质建立IVD产品的标准化和一致化，可实现临床检验结果的准确、可比和可溯源。

目前国际上研制标准物质的组织主要有英国国家生物制品检定所（National Institute for Biologi⁃cal Standards and Control，NIBSC），美国国家标准和技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST），位于比利时的标准物质和计量研究所（Institute of Reference Materials and Me⁃trology，IRMM）等。这些组织研制了大量的涉及无机成分、有机小分子、蛋白、抗体、激素、核酸等作为溯源的国际通用标准物质［2］。我国标准物质的研制工作起步稍晚，自上世纪80年代也开始研制临床检验标准物质，前期研制的标准物质以无机成分、微量元素为主，后期开始研制有机分子的标准物质，2005年前后开始研制核酸、蛋白等生物大分子的标准物质［3］。已有多家参考实验室通过了中国实验室合格评定委员会的认可，建立的参考方法涵盖了酶学、小分子化合物、血脂、代谢物、离子以及甾体类激素等［4］。并且为保证标准物质量值溯源体系的建设及标准物质的质量，相关实验室正在积极申请标准物质生产者能力认可。目前基本相应的建立了包含生物化学检测，免疫学检测，核酸检测，血液体液检测等几大类参考物质，这些参考物质为我国体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化做出了重要贡献。但是针对标准物质的研制和溯源体系在不同的机构有部分理解的不一致和差别，主要体现在标准物质的实际用途和组成形式上。有些机构认为标准物质的主要用途是为测量程序或校准品赋值，也有机构认为标准物质的作用还应该包含对产品的质量评价，不同的用途造成了标准物质组成形式的差别，也对标准物质的溯源体系造成了不一样的理解。本文拟就目前我国体外诊断试剂标准物质及其研制中所采用的主要形式进行简要介绍，并针对两种溯源体系的差别进行了阐述。

1 以参考方法或决定性方法和标准物质为主要溯源体系的标准物质

在计量学溯源途径中，生物化学检测标准物质一般都是应用已建立的参考方法进行定值，并附有给定置信水平的不确定度，多用于临床检验项目中的量值传递、准确度质量控制等。该类标准物质主要为定义明确的小分子化合物和蛋白质分子，前者主要包括代谢产物/底物类、离子类、非肽激素类、维生素与微量营养素等，后者包括酶和其他蛋白。

1.1 小分子化合物类标准物质

有机小分子临检项目的参考方法一般基于仪器分析原理，主要有同位素稀释质谱法（isotope dilution mass spectrometry，IDMS）、分光光度法及拉曼光谱法等。其中，同位素稀释质谱法是国际物质的量咨询委员会认定的基准测量方法，是目前国际公认的可准确测定小分子化合物的最可靠的分析原理之一。临床化学领域中，同位素稀释质谱法与色谱结合使用在建立代谢产物/底物类检测的参考方法中应用较广，国内现已建立针对肌酐、尿素、尿酸、葡萄糖、同型半胱氨酸、25⁃羟基维生素D、叶酸、游离甘油、甘油三酯、胆固醇的同位素稀释质谱参考方法，并且相应的已研制完成多项国家一级、二级标准物质［5，6］。考虑到互通性，这些标准物质一般采用公认无基质效应的新鲜冰冻人血清。例如血清总胆固醇、总甘油等标准物质的制备，首先要采集健康志愿者的血清，再将血清按照性别及胆固醇水平制备不同浓度的混合血清池，经过滤后分装完成样品制备；按照《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》（GB/T 15000.3⁃2008/ISO Guide35：2006）和国家一级标准物质技术规范（JJG 1006⁃1994）的要求进行均匀性和稳定性检验的设计和实验；对于候选标准物质的定值则采用已建立的同位素稀释液相色谱串联质谱和高效液相色谱法等参考方法，测定结果均可溯源至国际单位；最后再评价该标准物质的互通性及适用性［7］。通过此类方法制备的还包括冰冻人血清尿酸、肌酐成分分析标准物质，冰冻人血清中葡萄糖和冰冻人血清中尿素标准物质等。非肽类激素和离子类标准物质的参考测量方法主要也是同位素稀释质谱法，其制备原料的选择和制备过程也与代谢物/底物类相似，目前国内已经研制的标准物质包括雌二醇、17α⁃羟孕酮、孕酮和人血清钾、镁、钙等［8］。此外，在测定血清钙等离子类项目时，通常需要用多接收电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP⁃MS）先测定浓缩同位素的丰度比值，并计算浓缩同位素的浓度，不过国内已有实验室在英国政府化学家实验室同位素稀释法原理基础上建立了反应池⁃两步同位素稀释质谱法测定血清总钙的参考方法，大幅降低了实验对仪器性能的要求［9］。

1.2 酶学、血液学标准物质

酶催化浓度测量是临床检验的特殊情况，由于是活性测量，其测定结果依赖于测量过程。目前国际临床化学和实验室医学联盟（International Federation of Clinical Chemistry and laboratory med⁃icine，IFCC）共颁布8个技术文件，分别讲述37℃下测定肌酸激酶（creatine kinase，CK）等7种酶的催化浓度的参考方法。目前我国已有多家实验室建立了酶学参考方法并通过了酶学参考实验室的认证。酶学标准物质也采用了人源血清标本，相应的人血清中乳酸脱氢酶活性浓度标准物质，冰冻人血清中丙氨酸氨基转移酶等复合酶类催化活性浓度一级、二级标准物质也已制备完毕［10，11］。同时，国内多家实验室也参加了由IFCC组织的参考实验室室间比对，各种酶室间变异及小组均值与国外实验室网络相比没有明显差别［12］。

在血液体液检测领域，国内实验室在国际血液学标准化委员会委员的指导下，也相应建立了血细胞分析的参考方法，并与国外参考实验室长期进行高频率的结果比对。国内首家通过ISO 17025⁃2005和ISO 15195⁃2003认可的血细胞分析参考测量实验室也成功获批。此外，为解决血细胞分析检测结果的溯源问题，国内也以国际血液学标准化委员会（international council for standard⁃ization in haematology，ICSH）发布的参考方法为溯源标准研制出血细胞分析国家一级、二级标准物质，包括白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白测定和血小板计数，氰化高铁血红蛋白国家一级、二级标准物质等［13⁃14］。这些标准物质的研制和应用，对于推动我国血细胞分析标准化工作的发展具有重要意义。

由此可知，对于胆固醇、肌酐、葡萄糖、激素等被测量定义明确的小分子化合物，参考方法和标准物质的建立具有成熟的基础。但对于大多数蛋白分子建立参考方法仍然任重道远。建立的标准物质在IVD产品质量评价中可以用于准确度、线性、检测限等项目的样本（或样本之一），对于特异性等指标的评价则需要采用其他的样本进行。

2 采用多中心合作标定、一致化或类似一致化溯源体系的标准物质

多中心合作标定是通过多中心采用规定的方法或不同原理的方法进行特性值的赋值，通过统计学方式对多中心的赋值进行处理后给出靶值的方式，一致化简单的来说就是通过认可的方法，该方法并不是参考方法，依靠或不依靠参考物质对候选参考物质的特性量值进行赋值。在目前的临床检验项目中，存在参考方法的仅为少数，因此大多数检验项目、国内的大多数免疫和核酸标准物质都采用了一致化或类似一致化的溯源体系进行溯源。

2.1 免疫学标准物质

在蛋白质大分子的检测中主要使用免疫学检测技术，包含化学发光免疫检测方法、时间分辨免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫比浊法等。由于没有绝对权威的参考方法，目前世界卫生组织以及国内的实验室采用多中心合作研究的方式进行标准物质的定值。激素及肾上腺皮质激素等甾体激素的常规检验方法一般有免疫荧光分析和时间分辨荧光免疫分析等，国际检验医学溯源联合委员会也列举了部分非肽类激素的参考测量方法，但大部分激素现阶段无法通过参考方法的形式进行标准化。例如人绒毛膜促性腺激素（human cho⁃rionic gonadotropin，HCG）标准物质，因为在妊娠和滋养叶细胞疾病的妇女血清中，发现有多种具有免疫活性的HCG分子形式，他们包括完整HCG、脱β⁃羧基末端的HCG、β⁃HCG核心片段、缺刻HCG（Nicked HCG）、HCG糖变异体、游离β⁃HCG和游离α⁃HCG，对于参考方法溯源体系来说HCG分子则是定义不明确的分子。所以HCG标准物质就是采用多中心合作标定或者说类似一致化的溯源体系进行溯源。在建立HCG国家标准品过程中，首先精确量取来源于妊娠妇女尿液的高纯HCG原料、人血白蛋白和海藻糖，加入至磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH=7.4）内，无菌过滤后分装，再冻干制备成HCG国家标准品候选品。以HCG第五次国际标准品（07/364）为对照品，采用9个厂家10种HCG检测试剂盒（包括化学发光微粒子免疫法、化学发光法、电化学发光法、磁微粒分离酶联免疫法、酶联免疫法、时间分辨免疫荧光分析法等）进行协作标定，同时对候选品的瓶间精密度、稳定性进行分析。制备的候选品与国际标准品同质，满足用于HCG免疫分析及相应试剂盒的性能评价［15］。此外，类似于HCG，中国食品药品检定研究院还研制了胰岛素、三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸（即甲状腺素）、人胰岛素C⁃肽、促甲状腺激素、反三碘甲状腺原氨酸、促黄体生成素、促卵泡生成素、泌乳素、生长激素、人胎盘泌乳素等。

对于肿瘤标志物类以及感染性疾病抗原抗体的标准物质，现阶段国内也主要采用纯品或血清样本联合定值，并且大多溯源到NIBSC研制的国际标准物质。例如甲胎蛋白等就是使用高纯原料通过酶联免疫法、化学发光法等不同方法进行联合定值，溯源到国际标准品，其目的主要为试剂盒注册检验及市场流通监管，也有助于生产企业对其产品进行量值溯源［16］。乙型肝炎表面抗原、梅毒螺旋体抗体等是采用血清标准物质与国际标准品比对进行定值［17］。根据实际应用，标准物质也可以有不同组成，传染病体外诊断试剂标准物质一般由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量参考品、精密性参考品及定量参考品等组成［18］。国内目前已经研制的风疹病毒IgM抗体，丙型肝炎抗体，巨细胞病毒IgG、IgM抗体等多种标准品和参考盘等，大多是通过试剂盒筛选出阳性和阴性血清，再根据预设的性能指标制备参考盘，用于全面控制诊断试剂的质量，主要控制试剂的特异性、灵敏度、精密度及定量试剂的准确性等［19⁃20］。

需要注意的是，由于在三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸（即甲状腺素）、人胰岛素C⁃肽、反三碘甲状腺原氨酸等激素方面也发展了参考方法，对于此类同时存在两种溯源体系的情况，不同溯源体系的标准物质之间的相关性以及对检测试剂质量评价的影响也需要进行充分评估。

2.2 核酸标准物质

随着生物技术的进步，核酸检测在医学诊断领域得到广泛应用。但核酸检测易受到不同检测原理、样本基质、检测病毒基因变异、人群中基因多态性以及不同基因突变类型等多种因素的影响，导致不同实验室的检测结果，在准确性、量值、灵敏度和特异性方面也出现较大的差异。为使不同实验室，不同方法间检测的结果具有可比性，就必须使检测标准化。但由于缺乏一级参考测量程序，所以大部分核酸类标准物质也都是经过多中心合作联合定值，其制备过程已经程序化。在定值方法上，主要有紫外分光光度法、荧光染料法、实时荧光定量PCR法、磷元素同位素定量方法、脱氧单磷酸核苷定量的同位素稀释质谱法、数字PCR方法等。其中数字PCR方法是比较新的一种DNA定量技术，此方法不需要线性标准品即可计算出待检DNA分子的拷贝数，目前NIST等国际机构已有核酸标准物质采用数字PCR方法进行定值。但是现有的技术还很难从绝对意义上对核酸的量值进行确定。

一般WHO为病毒核酸扩增技术制定的国际参考物质来源于稀释后冻干分装的且含灭活野生型病毒的人混合阳性血浆，表述单位通常为IU（international unit）。这种标准物质量值为WHO经多中心研究确定其可以作为第一个国际标准物质或参考制剂后，通过主观方式赋予的一个标准数值，后来的替代标准则以第一个标准值为标准继续通过国际多中心合作来定值。规定IU可以使某种物质的生物活性在国际上使用同一种计量单位表示，而使不同于国际单位的单位体系具有互通性。

近年来国内在核酸标准物质的研制方面也做了大量的工作，早期研制的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸血清标准物质、丙型肝炎病毒核糖核酸血清标准物质被国家质检总局批准为国家二级标准物质，其量值可溯源到第一代国际标准品［21］。人脲原体核酸检测国家参考品，人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品等的建立也对相应检测项目进行了规范［22⁃23］。此外，国内已发布的核酸标准物质还包括乙型肝炎分型、丙型肝炎分型、人免疫缺陷病毒⁃1、人免疫缺陷病毒⁃1分型、人免疫缺陷病毒⁃2、沙眼衣原体、禽流感H7N9、结核分枝杆菌，EB病毒等。以上介绍的核酸标准物质大部分是用接近天然基体的生物材料制备而成。目前国内也有实验室采用人工合成的方法，基于MS2噬菌体衣壳蛋白包装外源RNA的病毒样颗粒，研制无生物传染危险性且稳定的RNA病毒核酸质控品和标准物质［24］。

同时，随着测序技术的大规模应用，为建立能对高通量测序技术平台及相关试剂产品进行有效性能评估，中国食品药品检定研究院采用多中心合作标定的方式研制了测序仪性能评价用DNA参考品和高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体参考品。针对高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体检测试剂盒的影响因素，如母亲外周血中胎儿游离DNA的含量、胎儿三体的不同类型（如标准三体、嵌合体以及平衡易位突变等）对结果的影响、DNA序列差异对结果的影响特别是高GC含量序列对结果的影响、小片段DNA分子在分离纯化中的片段筛选、文库构建中的偏移、测序文库的库容和量、在软件分析中采用的算法主要基于的统计学原理、在结果分析中原始数据是否符合统计学要求、参考数据库的建立等，高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体参考品中针对性的设计了数据量控制参考品、阳性参考品、微缺失微重复参考品、嵌合体参考品、检测限参考品、阴性参考品等参考品组成了参考盘，可以合理地进行产品质量评价。

3 展望

综上所述，自上世纪80年代以来，从无机元素、有机小分子逐渐发展到核酸、蛋白质等生物大分子的标准物质，从纯物质标准物质逐渐发展到基体标准物质，国内体外诊断试剂标准物质的研制工作有了长足的进步。随着精准医学大幕的拉开，相关的诊断技术将迎来快速发展的春天。为了保证临床诊断的检测质量，需要及时建立新的可靠的标准物质，这也就对我国体外诊断试剂量值溯源工作提出了更高的要求。相信在不久的将来，经认可的适用于临床检验的标准物质将会越来越多，它们将对临床检验的标准化、一致化检测起到积极作用，为临床正确诊断和合理用药提供重要依据。

［1］高尚先，黄杰.体外诊断试剂标准物质国内外现状［J］.药物分析杂志，2008，28（7）：1207⁃1213.

［2］武利庆.体外诊断试剂有证标准物质研究现状和趋势［J］.中国科技成果，2012（20）：50⁃52.

［3］原霖，韩焘，翟新验.核酸标准物质研究现状［J］.中国畜牧兽医，2014，41（11）：89⁃92.

［4］陈文祥，申子瑜，杨振华.临床生化检验参考方法的主要作用［J］.中华检验医学杂志，2008，31（3）：245⁃249.

［5］陈文祥，杨振华.临床生化检验参考方法发展历史与现状以及国内研究进展［J］.中华检验医学杂志，2009，32（5）：489⁃493.

［6］徐凤仙，于嘉屏.液相色谱串联质谱法测定血清中25⁃羟基维生素D2及25⁃羟基维生素D3含量［J］.检验医学，2015（8）：821⁃824.

［7］周伟燕，张传宝，董军，等.血清总胆固醇、总甘油、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇标准物质的研制［J］.中华检验医学杂志，2013，36（11）：1013⁃1017.

［8］彭絮，徐蓓，江红，等.血清雌二醇标准物质的研制［J］.化学分析计量，2015（4）：1⁃4.

［9］李胜民，王军.反应池⁃两步同位素稀释质谱法测定血清总钙［J］.化学分析计量，2015（5）：12⁃15.

［10］马怀安，徐国宾，王清涛.冰冻混合人血清酶学标准物质研制进展［J］.中国医药导刊，2010，12（5）：726⁃727.

［11］徐静，张建平，王清涛.探讨γ⁃谷氨酰基转移酶冰冻混合人血清候选标准物质的制备和稳定性［J］.首都医科大学学报，2012，33（2）：165⁃168.

［12］颜清，穆润清，康辉，等.国际酶学参考实验室室间比对四种酶学项目结果分析［J］.中华检验医学杂志，2014（5）：347⁃351.

［13］彭明婷，艾承锦，李臣宾，等.氰化高铁血红蛋白国家一级标准物质的研制［J］.中华检验医学杂志，2009，32（1）：97⁃101.

［14］彭明婷，谷小林，李臣宾，等.血细胞分析国家一级标准物质的研制［J］.临床输血与检验，2012，14（1）：1⁃5.

［15］于婷，黄杰，曲守方，等.人绒毛膜促性腺激素第三次免疫测定用国家标准品候选品的建立［J］.标记免疫分析与临床，2015，22（11）：1144⁃1148.

［16］王玉梅，刘艳，孙楠，等.免疫测定用甲胎蛋白国家标准品的制备与定值［J］.中国药事，2014，28（8）：843⁃846.

［17］王露楠，邓巍，张瑞，等.乙型肝炎表面抗原血清标准物质的研究［J］.中华检验医学杂志，2007，30（8）：858⁃862.

［18］曹丽梅，辛晓芳，周诚，等.传染病体外诊断试剂标准物质研制技术要求的介绍［J］.药物分析杂志，2011（11）：2196⁃2197.

［19］孙楠，黄杰，曲守方，等.风疹病毒（RV）IgM抗体质控盘的建立［J］.药物分析杂志，2013（1）：1⁃6.

［20］徐超，黄杰，曲守方，等.人巨细胞病毒IgG抗体质控盘的建立［J］.分子诊断与治疗杂志，2012，4（5）：308⁃313.

［21］叶子弘，赵煦泓，邹克琴，等.生物标准物质研究简析［J］.中国计量，2009（4）：67⁃69.

［22］王玉梅，李尔华，曾灵风，等.人脲原体核酸检测试剂盒国家参考品的制备［J］.中国生物制品学杂志，2014，27（8）：1042⁃1047.

［23］黄杰，王菲菲，徐超，等.人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品在评价人乳头瘤病毒核酸检测试剂中的应用［J］.药物分析杂志，2013（12）：2043⁃2046.

［24］Zhan S，Li J，Xu R，et al.Armored long RNA con⁃trols or standards for branched DNA assay for detec⁃tion of human immunodeficiency virus type 1［J］. Journal of Clinical Microbiology，2009，47（8）：2571⁃2576.

Quality evaluation of in vitro diagnostic reagents and traceability of reference materials

FU Yue1，GAO Xunian2，HUANG Jie3★
(1.Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing,China,101111;2.Guangzhou Bangdesheng Biological Technology Co.,Ltd,Guangdong,Guangzhou,China,510665;3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,China,100050)

Reference materials for in vitro diagnostic reagents are important in achieving the traceability of measurements and guaranteeing the quality of the test data as well as the result.Since the 1980s, domestic laboratories have done much work in the preparation of reference materials for in vitro diagnostic reagents.This article aims to introduce the reference materials of in vitro diagnostic reagents and its traceability systems:the metrological traceability system,which is based on reference procedures,reference materials,and reference systems;and the homogenization traceability system based on collaborative study to determine the assignment of value to reference materials.

In vitro diagnostic reagents;Reference materials;Traceability of measurements

1.北京市医疗器械检验所，北京101111 2.广州邦德盛生物科技有限公司，广东，广州510665 3.中国食品药品检定研究院，北京100050

★通讯作者：黄杰，E⁃mail：jhuang5522@126.com