TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力观察

沈凤，丁妍，谭玉洁, 3

(1贵州医科大学，贵阳 550000；2 湖北医药学院附属太和医院；3贵州医科大学附属医院)

TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力观察

沈凤1，丁妍2，谭玉洁1, 3

(1贵州医科大学，贵阳 550000；2 湖北医药学院附属太和医院；3贵州医科大学附属医院)

目的 观察TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力。方法 采用CRISPR/Cas9技术构建TET1敲除的Hela细胞株(观察组)，同时选择野生Hela细胞作为对照组。采用实时无标记动态细胞分析技术观察两组细胞增殖能力，计算两组90 h时的细胞指数(CI)值；采用Transwell实验观察两组细胞的侵袭能力。结果 观察组、对照组CI值分别为1.04±0.86、1.57±1.01，两组相比P<0.05。观察组、对照组24 h穿膜细胞数分别为(158±6)、(109±4)个，48 h穿膜细胞数分别为(206±12)、(142±7)个，两组相比P均<0.05。结论 TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖能力、侵袭能力增强。

宫颈癌；Hela细胞；TET1基因；CRISPR/Cas9技术；细胞增殖；细胞侵袭

DNA胞嘧啶甲基化是一个可逆性的调节基因表达的表观遗传学标志物，参与了细胞生理的关键过程，包括X染色体失活、印记和转录特异基因等[1]。TET蛋白家族在DNA胞嘧啶的去甲基化、胚胎发育和基因重新编码等过程存在重要作用，且与肿瘤的发生有关[2,3]，成员有TET1、TET2和TET3。TET1发现最早，是一种羟基化酶，能启动DNA去甲基化程序，调控胚胎干细胞的发育，并与肿瘤、神经系统、血液系统等疾病发病密切相关[4]。TET1在宫颈癌中的研究较少，因此本研究利用CRISPR/Cas9技术[5,6]构建了稳定敲除TET1的宫颈癌Hela细胞，并观察其细胞增殖、侵袭能力变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、仪器及试剂 Hela细胞和DH5ɑ感受态细胞由本实验室保存，pGK1.2质粒购自Invitrogen公司。基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶纯化/回收试剂盒、Taq PCR Mastermix、Matrige胶购自TIANGEN(天根)公司，转染试剂Lipofectamine3000 Reagent购自Invitrogen公司，T4DNA连接酶和T7E1酶购自NEB(北京)有限公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，DNA Marker购自碧云天公司，琼脂糖购自上海博亚公司。

1.2 TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞获取方法

1.2.1 oligo DNA设计和合成 通过CRISPR Design在线工具在靶标DNA区域中设计oligo DNA序列，为使pGK载体形成黏性末端，引物合成需在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC。分别设计3组oligo DNA，在位点上下游各设计1条引物，用于后续检测。TET1(Cas9)-1 F:5′-CACCGAGGCTTCTGACTGGCACGGG-3′,R：5′-AAACCCCGTGCCAGTCAGAAGCCTC-3′;TET1(Cas9)-2 F:5′-CACCGATCTGGAAGGCCTTGCATGG-3′,R：5′-AAACCCATGCAAGGCCTTCCAGATC-3′;TET1(Cas9)-3 F:5′-CACCGCCTTGGTTGTCTTTCGTAGT-3′,R：5′-AAACACTACGAAAGACAACCAAGGC-3′；T7E1 F:5′-GACCAAAACCTTGTGTGA-3′,R：5′-TGCTTCGTAGCGCCATTGTA-3′。

1.2.2 载体构建 将上述合成的2条单链oligo DNA退火形成双链的dsDNA，再将dsDNA连接到pGK1.2质粒，最后筛选阳性质粒。dsDNA形成体系：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，降温至25 ℃。连接反应体系：pGK1.2质粒150 ng，gRNA寡核苷酸双链1 μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1 μL，T4连接酶1 μL，补足双蒸水至10 μL，充分混匀后在PCR仪上4 ℃连接过夜。将连接过夜的产物转化到DH5ɑ感受态细胞中，然后挑取单克隆细菌到含有卡那霉素(pGK1.2为Kan抗性)的培养基中培养2 h，选择能在含有卡那霉素的培养基中正常生长带目的基因的阳性质粒。进行菌落PCR和2%琼脂糖凝胶电泳分析发现，只有TET1(cas9)-2在100 bp处有条带，将其菌液送到生工测序，并将测序正确的质粒进行扩增，用于下一步细胞转染实验。

1.2.3 细胞转染及基因组DNA提取 将上述Case9质粒转染到Hela细胞中，成功后提取基因组DNA进行后续PCR及T7E1检测。Hela细胞采用DMEM培养基和10%胎牛血清在37 ℃含5% CO2的恒温培养箱中培养。当6孔板中的Hela细胞密度达到60%左右时，使用脂质体介导的转染试剂Lipofectamine3000 Reagent将Case9质粒转染到Hela细胞中，质粒终浓度为1.5 μg/L，同时采用空白质粒作为阴性对照。转染操作均按试剂说明书进行。转染成功的Hela细胞会发出绿色荧光，可采用荧光显微镜观察。将转染质粒后的细胞培养72 h，取一部分细胞进行传代以及冻存保种，另一部分细胞消化后用PBS洗3次，按照试剂盒说明书的操作步骤提取基因组DNA。

1.2.4 TET1-gRNA的敲除效率检测 采用PCR、T7E1酶切法。PCR条件如下：Taq PCR Mastermix 5 μL，TET1(T7E1)-(F+R)0.5 μL，基因组DNA 2 μL，补水至10 μL。程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。先取上述反应后的产物5 μL，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带后进行T7E1检测。T7E1分析步骤如下：PCR产物5 μL，10×T7E1 Buffer 1 μL，补水至10 μL；使用PCR仪进行加热变性，退火处理95 ℃ 5 min，自然冷却至室温；将上述反应体系分别加入0.5 μL T7E1酶，37 ℃反应30 min后用2%琼脂糖凝胶进行分析。选取两孔转染TET1-gRNA质粒成功的Hela细胞(观察组)及野生型Hela细胞(对照组)，正常培养72 h后提取基因组DNA，T7E1酶切验证结果显示观察组细胞在约300、100 kb处均有敲除后的特异性条带，采用凝胶定量软件计算切割效率[7]，切割效率分别为54%和30%，对照组细胞只有500 kb条带。

1.2.5 细胞TET1蛋白检测 采用Western blotting法。将上述两组Hela细胞接种至96孔板培养，每孔单细胞接种，等细胞长到一定数量后扩增至24孔板，再等细胞长到一定数量后，扩增至12孔板，此时将细胞部分保种冻存，部分提取细胞蛋白，同时提取基因组DNA，PCR扩增目的片段，送生工测序。Western blotting法检测结果发现，对照组细胞正常表达TET1蛋白，观察组蛋白表达明显下调或缺失。

1.3 细胞增殖能力观察 采用实时无标记动态细胞分析技术。常规培养观察组、对照组Hela细胞，待其达到对数生长期时分别对两组细胞进行消化计数。采用25%的胰酶消化细胞，待细胞变圆变透亮时，弃掉胰酶加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化，吹打成细胞悬液后计数。每孔接种3 000个细胞，接种于无菌的E-plate细胞板，每孔设8个复孔。按照仪器使用说明书，在xCELLigence RTCA S16系统上培养90 h，自动实时记录细胞增殖情况并绘制曲线。计算两组90 h的细胞指数(CI)，CI值与细胞数量成正比，细胞量越多，CI值越高，细胞增殖能力越强[8]。

1.4 细胞侵袭能力观察 采用Transwell实验。在每个Transwell小室加入稀释后的Matrigel胶200 μL，置于培养箱中4 h后使用。在Transwell上室中加入200 μL无血清的DMEM，下室中加入500 μL含10% FBS的新鲜培养液DMEM。将观察组、对照组Hela细胞分别计数3 000个细胞加入到上室中培养。培养24、48 h后结晶紫染色，在显微镜下计算穿过聚碳酸酯膜的细胞数量，每张膜随机计数5个视野。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 观察组、对照组CI值分别为1.04±0.86、1.57±1.01，两组相比P<0.05。

2.2 两组细胞侵袭能力比较 观察组、对照组24 h穿膜细胞数分别为(158±6)、(109±4)个，48 h穿膜细胞数分别为(206±12)、(142±7)个，两组相比P均<0.05。

3 讨论

宫颈癌的发病与HPV感染有关，但HPV感染并不是导致宫颈癌发生发展的惟一因素，DNA甲基化也参与宫颈癌的发生及演进[9]。TET1是体内一种高效催化DNA胞嘧啶的加氧酶，具有明显的去甲基化作用。TET1在DNA去甲基过程、干细胞编程和抑制肿瘤细胞增殖等方面起关键作用，它发挥作用的主要方式是通过将5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶，并进一步转化为5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶达到DNA去甲基化目的。这几种物质之间存在着甲基化和去甲基化的动态平衡，如果TET1的表达缺失，这种平衡将被打破，就可能引起癌症的发生或发展。研究[10]发现，TET1在多种肿瘤如肝细胞癌、肺鳞状细胞癌、前列腺癌、膀胱癌中呈低表达。且TET1的减少或者缺失和癌症的发生和进展关系密切，如乳腺癌、肾癌、结直肠癌等[11]。

本研究细胞增殖试验结果显示，观察组CI比对照组高，表明观察组增殖能力增强。Transwell实验结果显示，观察组24、48 h的穿膜细胞数均比对照组多，表明观察组的侵袭能力增强。可见，降低TET1基因的表达水平，Hela细胞增殖、侵袭能力增强。Cimmino等[12]研究发现，TET1在造血系统中调节多种生理或病理过程，可能起抑癌基因作用。研究[13,14]发现，结肠癌、前列腺癌与乳腺癌组织中TET1基因表达下调。ONeri等[15]研究发现，TET1缺失促进了结直肠肿瘤细胞的侵袭和生长，还诱导了肿瘤细胞的转移；TET1过表达降低了肿瘤细胞的侵袭并抑制了其他部位转移瘤的形成。结合本研究结果推断TET1低表达可促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭。

可见，TET1表达的下调不仅与宫颈癌的侵袭、转移有关，而且可能是活化基因、诱导细胞增殖、导致肿瘤发生的重要因素之一。对TET1的深入研究将有助于弄清肿瘤的发生发展机制，对肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗有重要帮助。

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Proliferation and invasion abilities of TET1 gene knock-out Hela cervical cancer cells

SHENFeng1,DINGYan,TANYujie

(1GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China)

Objective To observe the proliferation and invasion abilities of ten-eleven translocation 1 (TET1) gene knock-out Hela cervical cancer cells. Methods We constructed the TET1 knock-out Hela cells by CRISPR/Cas9 technology, which were defined as the observation group. At the same time, we defined wild Hela cells as the control group. We observed the proliferation ability of Hela cells in the observation and control group by the real-time cellular analysis (RTCA), and calculated the cell index (CI) values in each group at 90 h. We observed the invasion ability of Hela cells in each group by Transwell assay. Results The CI value of the observation group was 1.04±0.86, which was higher than that of the control group (1.47±1.01) (P<0.05). At 24 h, the transmembrane cells in the observation group and the control group were 158±6 and 109±4, respectively; at 48 h, the of transmembrane cells in each group were 206±12 and 142±7, respectively; significant difference was found between these two groups (P<0.05). Conclusion The proliferation and invasion abilities of TET1 gene knock-out Hela cells become stronger.

cervical carcinoma; Hela cells; TET1 gene; CRISPR/Cas9 technique; cell proliferation; cell invasion

国家自然科学基金资助项目(81602297)；贵州省科技计划项目(黔科合基础2016-1121)。

沈凤(1986-)，女，硕士，初级检验师，主要从事宫颈癌及宫颈相关疾病的研究。E-mail: 449241354@qq.com

谭玉洁(1969-)，女，硕士，主任技师，主要从事宫颈癌及宫颈相关疾病的研究。E-mail: 943356809@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.007

R737.33

A

1002-266X(2017)22-0023-03

2016-12-05)