过表达miR-200c对人髓核细胞凋亡的影响及其机制

陈林建，李朝晖，蓝国波

(广东医科大学附属佛山禅城医院，广东佛山528031)

过表达miR-200c对人髓核细胞凋亡的影响及其机制

陈林建，李朝晖，蓝国波

(广东医科大学附属佛山禅城医院，广东佛山528031)

目的 观察过表达miR-200c对人髓核细胞(HNPCs)凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 体外培养HNPCs，将HNPCs分为观察组、阴性组和空白组，观察组转染hsa-miR-200c mimics，阴性组转染阴性对照mimics-NC，空白组未经任何干预。转染后24 h，采用real-time PCR法检测3组细胞miR-200c的表达，流式细胞仪测算细胞凋亡率，ELISA平板计数法检测Caspase3/7活性，Western blotting法检测3组细胞酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)蛋白。结果 观察组、阴性组和空白组细胞miR-200c相对表达量分别为8.11±0.21、1.07±0.04、0.99±0.05，细胞凋亡率分别为23.6%±3.1%、1.5%±0.2%、1.6%±0.1%,Caspase3/7活性分别为299.237±24.245、119.476±10.657、117.317±11.317,TrkB蛋白相对表达量分别为0.48±0.11、0.50±0.12、0.15±0.06,观察组与阴性组、空白组比较，P均<0.01。结论 过表达miR-200c能够促进HNPCs的凋亡，其机制可能与调控TrkB的表达有关。

微小RNA-200c；人髓核细胞；细胞凋亡；酪氨酸蛋白激酶受体B蛋白

椎间盘退变是脊柱退行性疾病的病理基础，患病率呈逐年上升趋势[1]。目前椎间盘退变的具体机制尚不明确，年龄、生物力学、机械因素、炎性因子、基因等多种因素可能参与了此病理过程。基因因素在椎间盘退变中的作用近年来受到学者的广泛关注[2～4]。髓核细胞的凋亡是椎间盘退变发生的重要机制[5]，导致的髓核细胞数量减少是椎间盘退变主要形态学改变之一[6]，但目前引起髓核细胞凋亡的具体机制尚不完全明确。微小RNA(miRNA)是一类存在于生物体中可以调控基因表达的内源性非

编码小分子RNA，通过降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻译对靶基因进行调节[7]。miRNA芯片检测技术发现，退变椎间盘组织中存在着大量异常表达的miRNA[8,9]，影响髓核细胞的增殖及凋亡，与椎间盘退变密切相关[10,11]。miR-200c是miR-200家族成员之一，在严重腰椎间盘退变患者腰椎间盘组织中表达明显增高[9]。miR-200c在多种细胞中具有调节细胞凋亡的作用[12～14]，但是否影响髓核细胞的凋亡尚不明确。2015年10月～2016年7月，本研究在体外建立高表达miR-200c的人髓核细胞(HNPCs)，模拟椎间盘退变患者椎间盘组织中miR-200c的高表达状态，观察过表达miR-200c对HNPCs凋亡的影响，以探讨miR-200c在椎间盘退变中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 HNPCs购自Scien Cell公司。hsa-miR-200c mimics及阴性对照mimics-NC均购自广州锐博生物科技公司；逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；miR-200c及U6引物由上海吉凯基因公司设计合成；TRIzol试剂和Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司；Apo-ONE Homogeneous Caspase3/7检测试剂盒购自Promega公司；鼠抗人酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)、GAPDH单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 将HNPCs分为观察组、阴性组和空白组。将3组HNPCs培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规传代，待细胞生长密度达70%～80%时，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书进行转染。观察组转染hsa-miR-200c mimics，阴性组转染mimics-NC，空白组未经任何干预。

1.2.2 各组miR-200c检测 采用real-time PCR法。转染后24 h，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，以miR-200c逆转录引物作为茎环结构引物进行反转录，取反转录物进行real-time PCR。PCR反应条件为95 ℃ 3 min、95 ℃10 s、59 ℃ 30 s，共40个循环。miR-200c上游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3′，下游引物：5′-CGCTAATACTGCCGGGTAATG-3′；内参U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATTTT-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。实验重复3次。采用2-ΔΔCt法计算miR-200c相对表达量。

1.2.3 各组细胞凋亡率测算 收集转染后24 h各组HNPCs，以不含EDTA的胰酶消化后离心收集细胞，PBS洗涤细胞，调整细胞密度为(1～5)×105/mL，加入Annexin V-FITC染色，随后加入PI染色，室温孵育15 min，上流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.4 各组Caspase3/7活性检测 将转染后24 h各组细胞接种于96孔板，室温解冻100×Caspase底物和Apo-ONE Caspase3/7缓冲液，将底物与缓冲液按试剂盒说明书混合后，每孔加入100 μL的Caspase试剂混合液，摇床轻摇混均30 s，室温避光孵育2 h，应用ELISA平板计数器检测490 nm细胞荧光强度。

1.2.5 各组TrkB蛋白检测 取转染后24 h各组细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白样品浓度。每组取等量蛋白上样，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳30 min，室温5%脱脂牛奶封闭1～2 h，加入适当浓度一抗，4 ℃过夜，次日洗膜后，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜后，ECL发光。用Image J软件进行结果分析，TrkB蛋白的相对表达量以其与管家基因GAPDH灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 各组miR-200c表达比较 观察组、阴性组和空白组细胞miR-200c相对表达量分别为8.11±0.21、1.07±0.04、0.99±0.05，观察组与阴性组、空白组比较，P均<0.01。

2.2 各组细胞凋亡率比较 观察组、阴性组和空白组细胞凋亡率分别为23.6%±3.1%、1.5%±0.2%、1.6%±0.1%,观察组与阴性组、空白组比较，P均<0.01。

2.3 各组Caspase3/7活性比较 观察组、阴性组和空白组Caspase3/7活性分别为299.237±24.245、119.476±10.657、117.317±11.317,观察组与阴性组、空白组比较，P均<0.01。

2.4 各组TrkB蛋白表达比较 观察组、阴性组和空白组TrkB蛋白相对表达量分别为0.48±0.11、0.50±0.12、0.15±0.06,观察组与阴性组、空白组比较，P均<0.01。

3 讨论

髓核细胞在维持椎间盘的完整性方面起着重要的作用，髓核细胞能够产生Ⅱ型胶原、蛋白多聚糖和其他细胞外基质成分来维持椎间盘的完整性。越来越多的证据表明，髓核细胞的凋亡参与了椎间盘退变的发生、发展。近年来研究证实miRNA广泛参与蛋白质表达的转录后调控，在机体众多病理及生理过程中发挥着重要的调节作用。miRNA参与调控多个靶基因，异常表达会造成调控基因的表达异常，从而参与疾病的发生、发展。目前miRNA在许多疾病中的作用机制已经被陆续研究阐明，但是其在椎间盘退变中的研究尚处于起步阶段。

研究报道，miR-210在退变髓核组织中表达明显降低并且通过靶向HXOA9调控髓核细胞的凋亡[10]。miR-138-5p在退变髓核组织中表达增高，通过SIRT1/PTEN/PI3K/Akt信号通路调控髓核细胞的凋亡[11]。miR-200c基因簇定位于12号染色体p13.31，与恶性肿瘤凋亡密切相关。杜宪红等[12]发现CIK细胞通过上调miR-200c促进胃癌细胞的凋亡。朱名毅等[14]报道，过表达miR-200c可以抑制舌癌Tca8113细胞增殖并诱导癌细胞的凋亡。Zhao等[9]研究发现,严重腰椎间盘退变患者腰椎间盘组织中miR-200c表达明显升高，于是我们推测miR-200c可能与髓核细胞的过度凋亡有关。为了模拟椎间盘突出患者椎间盘组织中miR-200c的高表达状态，本研究采用特异性转染试剂Lipofectamine转染miR-200c mimics进入体外培养的HNPCs，real-time PCR法检测证实，转染后髓核细胞中miR-200c表达量较阴性组和空白组增高，成功在髓核细胞内过表达miR-200c。随后通过流式细胞术检测发现，过表达miR-200c后髓核细胞的凋亡率明显增高，Caspase3/7活性分析进一步证实过表达miR-200c后细胞内凋亡相关活性酶活性明显增高，提示miR-200c具有促进髓核细胞凋亡的作用。

miRNA的功能主要取决于其下游靶基因的生物学效应。为了进一步探讨miR-200c调控髓核细胞凋亡可能的作用机制，本研究运用生物学软件(TargetScan、miRanda)预测miR-200c的靶基因可能为神经营养性酪氨酸激酶2型受体(NTRK2),NTRK2的3′UTR区存在与miR-200c的种子序列理论上互补的结合位点。研究[15]发现，miR-200c在乳腺癌中能够直接作用于NTRK2，下调NTRK2促进凋亡作用的启动，并且通过实验证实上调NTRK2能有效逆转miR-200c对乳腺癌细胞的促凋亡作用。因此结合预测结果，本研究推测miR-200c可能调控NTRK2在髓核组织的退变中起重要作用。NTRK2基因编码的蛋白质称为TrkB。本研究通过Western blotting法检测证实，在髓核细胞过表达miR-200c后，TrkB蛋白表达水平明显降低，说明在HNPCs中miR-200c与NTRK2之间存在负向调控关系。NTRK2(TrkB)是脑源性生长因子受体，是细胞增殖、分化、凋亡信号通路中的关键调控因子，已有研究证实下调NTRK2(TrkB)能够促进细胞的失巢性凋亡[16]，并且能够增强癌细胞的失巢凋亡敏感性[15]。可见miR-200c可能通过调控NTRK2表达参与椎间盘退变的发生发展，有望成为椎间盘退变靶向治疗的基因靶点。

综上可见，过表达miR-200c能够促进HNPCs的凋亡，其机制可能与调控TrkB的表达有关。

[1] Vos T, Flaxman AD, Naghavi M, et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet, 2012,380(9859):2163-2196.

[2] Mayer JE, Iatridis JC, Chan D, et al. Genetic polymorphisms associated with intervertebral disc degeneration[J]. Spine J, 2013,13(3):299-317.

[3] Livshits G, Popham M, Malkin I, et al. Lumbar disc degeneration and genetic factors are the main risk factors for low back pain in women: the UK Twin Spine Study[J]. Ann Rheum Dis, 2011,70(10):1740-1745.

[4] Williams FM, Bansal AT, van Meurs JB, et al. Novel genetic variants associated with lumbar disc degeneration in northern Europeans: a meta-analysis of 4600 subjects[J]. Ann Rheum Dis, 2013,72(7):1141-1148.

[5] Roberts S, Evans H, Trivedi J, et al. Histology and pathology of the human intervertebral disc[J]. J Bone Joint Surg Am, 2006, 88 Suppl 2:10-14.

[6] Freemont AJ. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain[J]. Rheumatology (Oxford), 2009,48(1):5-10.

[7] Bartel DP. MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

[8] 王涛,马信龙,张晓林,等.人退变腰椎间盘差异性表达microRNA的筛选及JNK通路参与椎间盘退变的探讨[J].中华骨科杂志,2013,54(7):770-775．

[9] Zhao B, Yu Q, Li H， et al. Characterization of microRNA expression profiles in patients with intervertebral disc degeneration[J]. Int J Mol Med, 2014,33(1):43-50．

[10] Zhang DY, Wang ZJ, Yu YB, et al. Role of microRNA-210 in human intervertebral disc degeneration[J]. Exp Ther Med, 2016,11(6):2349-2354.

[11] Wang B, Wang D, Yan T, et al. MiR-138-5p promotes TNF-α-induced apoptosis in human intervertebral disc degeneration by targeting SIRT1 through PTEN/PI3K/Akt signaling[J]. Exp Cell Res, 2016,345(2):199-205.

[12] 杜宪红,邢召全,焦晋山,等.miR-200c在CIK细胞诱导胃癌细胞凋亡中的作用[J].山东大学学报(医学版),2013,51(6):49-52.

[13] Venkatadri R, Muni T, Iyer AK, et al. Role of apoptosis-related miRNAs in resveratrol-induced breast cancer cell death[J]. Cell Death Dis, 2016,7:e2104.

[14] 朱名毅,姚金光,刘津,等.miR-200c对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响[J].重庆医学,2015,44(10):1322-1324.

[15] Howe EN, Cochrane DR, Richer JK. Targets of miR-200c mediate suppression of cell motility and anoikis resistance[J]. Breast Cancer Res, 2011,13(2):R45．

[16] Douma S, Van Laar T, Zevenhoven J, et al. Suppression of anoikis and induction of metastasis by the neurotrophic receptor TrkB[J]. Nature, 2004,430(7003):1034-1039．

广东省佛山市卫生和计划生育局医学科研课题(20160148)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.010

R681.5

A

1002-266X(2017)22-0030-03

2016-11-12)