RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

陈会花(综述) 章 忱 吕 嵘(审校)

(上海中医药大学病理教研室 上海 201203)

RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

陈会花(综述) 章 忱 吕 嵘△(审校)

(上海中医药大学病理教研室 上海 201203)

心力衰竭在细胞水平主要表现为心肌以兴奋-收缩耦联(excitement-contraction coupling,ECC)为基础的收缩功能障碍,而Ca2+信号转导在此过程中起着非常重要的作用。肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)兰尼碱受体(ryanodine receptor type 2,RyR2)是心肌最重要的钙释放通道,RyR2磷酸化是肌浆网钙释放的基础,而RyR2磷酸化主要受蛋白激酶A (protein kinase A ,PKA)和钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的调控。目前对RyR2磷酸化的研究已经非常广泛,但对其涉及心力衰竭的具体发病机制仍有争议,本综述主要针此问题进行阐述。

兰尼碱受体; 心力衰竭; 蛋白激酶A; 钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ

目前,心衰是引起死亡率和发病率升高的一个主要原因,严重威胁人类的生命健康。据最新研究[1]报道,全球每年约有1 750万人死于心血管疾病,占全球死亡人数的31.25%,有研究[2]预测至2030年,死亡人数可能增至2 330万,国外流行病学资料[3]显示,心衰患者5年存活率为50%,40%的患者1年内会因心衰再次入院,有临床症状的患者5 年存活率更与肿瘤患者相似。

兰尼碱受体(RyR2)在兴奋收缩耦联中的作用 细胞膜去极化导致L-型钙通道(L-type Ca2+channels,LTCCs)开放,胞外Ca2+内流,激活位于SR上的(ryanodine receptor type 2,RyR2),使SR中的Ca2+大量释放进胞质,这个过程就是“钙诱导的钙释放”(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)[4]。位于横管的LTCCs和位于肌浆网的RyR2极为贴近,这种高度精准的结构是引起“钙瞬变”的基础。胞质Ca2+浓度的升高可激活肌球蛋白头部的Ca2+-Mg2+-ATP酶,水解ATP释放能量,引发心肌收缩,完成由化学能向机械能的转化,形成一次兴奋-收缩耦联[5]。心肌收缩后胞质内游离的Ca2+经SR上的钙泵肌质网钙ATP酶(sarco /endoplasic Ca2+-ATPase,SERCA)泵回SR 中储存,另外多余的Ca2 +经钠钙交换体(Na+/Ca2+-exchanger,NCX1)泵出胞外[6]。

心衰过程中,心脏需要经历代偿性的改变,这种改变最终抑制胞内的钙循环,并且降低SR内的钙容量。因此,钙诱导释放的Ca2+就会减少,最终导致兴奋-收缩耦联时产生的收缩力降低[7]。RyR2是兴奋-收缩耦联过程中主要的Ca2 +释放通道,SR经RyR2释放Ca2+的量决定了钙瞬变的幅度,而钙瞬变的幅度与心肌收缩的力度相关[5]。

RyR2结构及其磷酸化 RyR2属于RyR家族,是目前已知相对分子质量最大的离子通道,根据RyR最初纯化的时间和组织来源不同,RyR受体共有3种亚型:RyR1、RyR2和RyR3,而RyR2主要分布于哺乳动物心肌细胞中[8]。最近Zalk等[9]成功解析了RyR的结构,RyR2是一种同源四聚体,四个原聚体围绕成一个中央横跨膜的孔隙,这个孔隙与四聚体的四重对称轴一致。每个结构是以重复延伸的α-螺线管结构(α-solenoid)为基础的,α-solenoid由5部分组成:3个SPRY区域(SPRY1,SPRY2和 SPRY3)和2对重复序列的RYR(RY12和 RY34),许多辅助蛋白都结合在α-solenoid上,包括FKBP12.6、钙调蛋白、肌集钙蛋白-2、连接素、三合蛋白、亲连蛋白-2。另外原聚体还含有嵌入的EF-hands,它是以前假设的Ca2+结合域的主要组成,是钙离子激活构象的开关,因此与Ca2+结合的EF-hands可以调节形成孔隙的跨膜螺旋管的构象,这样每次离子大振幅的集体运动就可以增加通道打开的概率。这个机制也很好的解释了Ca2+的结合是如何增加通道打开的机率却不改变打开的周期,同时也可以解释RyR胞质区结合的调节蛋白是如何起门控作用[9-11]。

RyR2有多个磷酸化位点,每一个位点磷酸化的稳态程度受多重蛋白激酶和磷酸酶的动态平衡影响,这可以精确的调控RyR2的磷酸化,最终调控通道活性。虽然丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶也有可能磷酸化RyR2,但大多数的研究主要在PKA和CaMKⅡ介导RyR2磷酸化方面[12-13]。

丝氨酸-2808(serine-2808,S2808,一些物种是S2809)是第一个被认证为RyR2残基的磷酸化位点,并且被认为是PKA磷酸化RyR2的主要靶点。Marx等[13-14]和Wehrens等[15]在二维的脂质双分子层结构上实验,发现增加PKA纯度可以增加单个RyR2通道打开的概率;若将S-2808突变为丙氨酸后,RyR2则不能被PKA磷酸化,RyR2通道打开的概率不会增加[16]。

丝氨酸-2814 (S2814,一些物种是S2815) 是第2个被认证为RyR2残基的磷酸化位点,它是CaMK II磷酸化RyR2的主要靶点[16]。虽然对CaMK II磷酸化RyR2的作用靶点仍有争议,但目前存在的一个共识是CaMKII介导RyR2磷酸化可以增加RyR2通道打开的概率。有研究[9]报道,不论在磷脂双分子层的单通道水平还是在心室肌细胞水平上,都显示CaMK II促进钙火花频率增加。Wehrens等[15-16]和Respress等[17]将S2814突变后,可以抑制CaMK II对RyR2的主要作用,这提示S2814是CaMKII磷酸化RyR2的主要靶点,但不是唯一靶点。

几年前,丝氨酸-2030 (S2030,有些物种是S2031)曾被认为是RyR2磷酸化第3个靶点。Xiao等[18]实验发现,PKA磷酸化RyR2 S2030位点可以增加肌质网对Ca2+的敏感性。但Wehrens等[15]和Huke等[19]都没有证明这个磷酸化位点,因此S2030的生理功能还有待进一步研究。

心衰过程中RyR2磷酸化的改变 RyR2磷酸化在心衰中起重要作用,在心衰患者和动物模型中,我们都可以观察到RyR2硫酸化增加导致的SR钙渗漏增加[20-21]。然而,RyR2磷酸化在心衰中的病理机制存在很大的争论。

PKA介导RyR2的过度磷酸化 最早证明心衰患者RyR2磷酸化发生改变的文章是由Marx等[14]在2000年发表。Marx等[14]Wehrens等[15]和Shan等[22]提出一个假设:心衰时交感神经兴奋,激活PKA介导的RyR2 S2808过度磷酸化,同时抑制FKBP12.6与RyR2结合,增加RyR2打开的概率。

但此假设目前存在很大争议。最大的争议就是RyR2 S2808过度磷酸化是否在心衰过程中起决定性作用。Wehrens等[15]认为RyR2 S2808磷酸化在实验性心肌缺血诱导的心衰进程中起关键作用。他们用RyR2 S2808敲除小鼠和野生型小鼠同时进行心肌缺血造模,造模4周后进行心功能检测,结果显示RyR2 S2808敲除小鼠较野生型小鼠在射血分数、收缩分数、每搏输出量、左室内压最大上升速率以及左室内压最大下降速率等心功能方面明显改善。同时,他们还发现RyR2 S2808敲除小鼠的RyR2不能被PKA磷酸化,并且PKA失去对FKBP12.6的调节,导致FKBP12.6不能与RyR2解离。然而,Zhang等[23]和Houser等[24]却认为PKA介导的RyR2 S2808过度磷酸化并不能改变心肌收缩性,也不能改善心衰和心律失常的症状。他们同样用RyR2 S2808敲除小鼠和野生型小鼠同时进行心肌缺血造模,造模4周后进行心功能检测,却发现心功能没有任何改善。他们认为目前对交感神经系统调控心肌收缩的分子机制研究已经非常透彻,并且经典的β-肾上腺素受体激活LTCCs和SERCa的PLN通路完全可以解释。PKA介导的LTCCs- RyR2复合体磷酸化可以增加LTCCs打开的概率,导致Ca2+内流增加,这一过程与交感神经调控一致。由于LTCCs介导的CICR完全可以激活兴奋-收缩耦联,所以这些反应不会明显改变释放储存钙离子复合物的数量。然而,通过激活交感神经增加LTCC钙内流,可以增加肌质网的钙储备,使肌质网钙负荷逐渐增加。经LTCC流入的钙离子主要用于肌质网的钙释放和钙负荷,这是近几十年被公认的。

结构是功能的基础,同时功能也改变结构,最近对RyR2结构的解析越加明确,从结构上支持第一种观点;Houser等实验存在最大的一个问题是样本数量少,所以结果存在假阳性和假阴性的可能比较大;对于关键的心功能检测,Wehrens等[15]用M型超声和压力-容积电导导管技术同时进行检测,而Houser等只用M型超声检测心功能。

CaMKⅡ介导的RyR2磷酸化 目前许多研究[25-28]认为CaMKⅡ通过氧化应激通路或者基因突变介导RyR S2814磷酸化,使RyR2通道在舒张期或兴奋-收缩耦联时激活释放Ca2+。因为在心肌梗死、急性或慢性胸主动脉缩窄、缺血再灌注损伤以及异丙肾上腺素、血管紧张素II、醛固酮诱导等多种心衰模型中,CaMK II抑制剂在都可以起作用。Van Oort等[11]发现,CaMKⅡ介导RyR2磷酸化是心衰、心律失常发生的主要原因。但Wehrens等[16]发现,在非缺血的扩张性心肌病患者中,RyR2 S2815磷酸化水平升高,而在缺血性心肌病中,RyR2 S2815磷酸化水平则不会升高。同时他们用RyRS2814A (点突变)的小鼠再次进行验证,发现当RyRS2814A小鼠用胸主动脉结扎诱导压力超负荷的心力衰竭模型时,可以显著降低肌质网的Ca2+渗漏,增加肌质网的Ca2+负荷,显著改善EF、FS、+dP/dt等心功能指标;但是,如果RyRS2814A小鼠用心肌梗死诱导心衰模型时,则不会出现这种改变。这与他们在临床观察到的结果相一致。另外,他们用野生型小鼠行胸主动脉结扎术,发现造模后8～16周,RyR2 S2814A磷酸化水平显著增加。

最新研究[29]表明,PKA和CaMKⅡ在调控RyR2磷酸化时是有交互作用的,PKA既可以通过Ca2+直接激活CaMKⅡ,又可以通过激活磷酸二酯酶从而抑制CaMKⅡ;而CaMKⅡ同样也可以通过激活磷酸二酯酶从而抑制PKA的活性。

从大量文献可以看出,RyR磷酸化在心衰过程中的关键作用是毋庸置疑的,但具体是通过哪条通路,激活哪个位点仍有很大的争议。引起争议的原因有很多,例如心衰模型类型、动物背景、实验方法、试剂等等。由于调控RyR2的上游信号分子众多,信号通路复杂,所以实验条件稍有不同就会导致结果大相径庭。但科技在不断进步,最近Peng等[30]首次报道了RyR2处于关闭和开放两种不同状态的近原子分辨率冷冻电镜三维结构,这无疑是分子结构领域的重大突破,这对研究RyR2在心衰时的结构改变以及作用机制都有巨大的帮助,同时也为心衰时对RyR2进行靶点治疗提供了可能。

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The role of RyR2 phosphorylation in heart failure

CHEN Hui-hua, ZHANG Chen,LYU Rong△

(DepartmentofPathology,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Heart failure is mainly characterized by myocardial systolic dysfunction ,which is based on excitement-contraction coupling on the cellular level,and calcium (Ca2+)signaling plays a very important role in this process.The ryanodine receptor (RyR)/calcium release channel on the sarcoplasmic reticulum (SR) is the major Ca2+source of required for cardiac muscle excitation-contraction coupling.RyR2 phosphorylation is the basis of SR calcium release,and RyR2 phosphorylation is mainly controled by protein kinase A (PKA) and calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ).Although widely research in this area,excessive activation of RyR2 phosphorylation involved in the pathogenesis of heart failure are still controversial,which is discussed in this review.

ryanodine receptor; heart failure; protein kinase A; calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ

国家自然科学基金(81373858)

R541.6

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.03.018

2016-07-28;编辑:王蔚)

△Corresponding author E-mail:lurong@shutcm.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373858).