外泌体在缺血性脑卒中的研究进展

瞿笑丰，陈丽欣，萧文泽

·综述·

外泌体在缺血性脑卒中的研究进展

瞿笑丰a，陈丽欣b，萧文泽c

外泌体是一种新近发现的细胞外小分子囊泡，其参与调节缺血性卒中后神经细胞重塑以及血管新生。本文总结了外泌体在缺血性卒中修复过程中的研究进展，并探讨缺血性卒中治疗中干细胞来源外泌体的潜在应用价值。

外泌体；缺血性卒中；血管新生；神经细胞可塑性；造血干细胞治疗

外泌体（exosomes）存在于体液如血液和脑脊液中[1]，是内体衍生的小膜泡，直径约 30～100 nm，由细胞释放到细胞外液[1]。其内携带有蛋白质、脂类和遗传物质，在源细胞和受体细胞间起着关键的细胞间通讯作用[1]。数据表明，外泌体也参与调节卒中后神经血管单元组件细胞间的通讯。笔者总结了外泌体在卒中后修复中的研究进展，并探讨脑卒中治疗中外泌体的潜在应用价值。

1 外泌体调节缺血性卒中相关miRNA水平

在局灶性脑缺血小鼠模型中下调脑血管内皮细胞 miRNA-15a，可以促进缺血周边区的血管新生[3]。血管内皮细胞释放的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可与神经祖细胞的血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2）结合，促进其增殖和分化。此外，脑白质内皮细胞通过脑源性神经营养 因 子（brain derived neurophic factor，BDNF）和 脑源性成纤维细胞生长因子 2（fibroblast growth factor 2，FGF2）参与髓鞘少突胶质细胞的再生[2]。卒中诱发的有限的神经芽生和缺血周边区轴突的髓鞘再生也受到 miRNA 的调控[4]。而反应性增生的星形胶质细胞产生的硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）则抑制轴突再生[5]。皮质神经元过表达 miR-17-92 基因簇或 miR-27a，可激活神经元的内在生长信号通路，这主要通过抑制磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tension homolog，PTEN）和 Ras同源家族成员（RhoA）信号，从而克服 CSPG 的抑制作 用[6]。 因此，miRNA 和 mRNA的介导信号网络在卒中脑修复过程中起到关键性作用[7]。外泌体介导的细胞间通讯通过将生物分子从源细胞转移至靶细胞也参与神经功能的修复。外泌体通常富含 tetraspanin 蛋白（CD63、CD81），核内体调节器 Alix，和伴侣蛋白 HSP70，其携带的成分有脂类、蛋白和 RNA，包括 mRNA 和 miRNA[1]。

2 外泌体调节缺血性脑卒中后血管新生

循环内皮祖细胞分泌的外泌体可将其包含物转移到受体内皮细胞，其中包含 PI3K/Akt信号通路相关 miRNA 和促血管生成相关的 miRNA，如 miR-126 和 miR-296。在大脑，培养的胶质瘤细胞分泌的外泌体提供促血管生成的蛋白质、mRNA和miRNA给脑血管内皮细胞，诱导新生血管生成。此外，人脑微血管内皮细胞也分泌外泌体[8]。小鼠脑内皮细胞分泌的外泌体在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激和细胞因子刺激下转移miRNA、mRNA和受体至小鼠脑血管周细胞，提高了VEGF-B及其受体VEGFR-1 蛋 白 水 平[9]，介 导 血 管 生 成 。 Delta-like 4（DLL4），一种脑内皮细胞表达的膜结合 Notch 配体，通过与周细胞的 Notch3 受体结合，保持脑血管结构稳定[10]。人类微血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞释放的外泌体含有DLL4蛋白，参与调节血管生成[11]。

蛋白质组学和基因芯片分析显示，与非缺血组相比，缺血性卒中从本质上改变了外泌体所装载的miRNA 与蛋白成分[12]。 缺血性神经祖细胞来源的外泌体促进初级内皮细胞迁移和毛细血管的形成，而缺血性脑血管内皮细胞外泌体促进了神经祖细胞的增殖和分化[12]。这表明，脑血管内皮细胞和神经祖细胞的外泌体共同参与了卒中后大脑修复过程中的神经和血管生成过程。

3 外泌体促进缺血性脑卒中后神经再生

成年老鼠大脑神经干细胞存在于脑室/脑室旁区（ventricular/subventricular,V/SVZ），此 区 域 毗 邻血管和脑脊液，不断地交换分子信号[13]。脑脊液和神经干细胞释放的外泌体各自通过调节细胞间信号途径，介导的神经干细胞的功能和免疫功能[14]。脑脊液来源外泌体激活胚胎神经干细胞 IGF/mTORC1通路，促进干神经细胞的增殖[14]。将成年老鼠的胚胎神经干细胞暴露在促炎性因子环境中，促使其释放干扰素信号通路γ相关成分。这些外泌体通过所装载的干扰素 γ及其受体 IFNGR1 激活靶细胞内STAT1 信号通路[15]。卒中可以激活先天免疫和适应性免疫反应，因此，神经干细胞释放的外泌体也可能参与了卒中后免疫系统细胞相互作用。

4 外泌体调节缺血性脑卒中后神经细胞可塑性

神经元和神经胶质细胞相互作用来协调轴突生长和髓鞘形成，这两者释放的外泌体也参与这些过程[16]。神经元释放的外泌体含有α-氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPA）受体，而去极化神经元其突起释放的外泌体富含微管相关蛋白 1B（MAP1B）和 miRNA 靶 基 因 ，这 些 成 分 均 参 与 了 神 经 可 塑 性[17]。 维 甲 酸 受 体RARβ2激动剂通过释放富含PTEN蛋白的外泌体抑制皮质神经元PTEN信号转导。同时，这些PTEN蛋白的外泌体与PTEN星形胶质细胞结合，抑制星形胶质细胞增殖[18]。此外，皮质神经元外泌体转移 miR-124 至星形胶质细胞，促使星形胶质细胞上调兴奋性氨基酸谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1，GLT-1）表达，调节星形胶质细胞的功能[19]。AMPA 受体和 MAP1B 是突触可塑性和轴突出芽的关键调节受体[17]。而在啮齿动物，星形胶质细胞GLT-1主要负责调节细胞外谷氨酸水平和调节突触活化[19]。AMPA 受体的激活有助于脑卒中后运动功能恢复[20]。总之，外泌体介导了神经元和星形胶质细胞之间突触传递和生物分子的交流[17]，参与调节了神经元突触和轴突可塑性。

5 外泌体影响缺血性脑卒中模型中神经胶质细胞功能

高浓度氯化钾导致新生小鼠星形胶质细胞释放外泌体，他们富含突触囊泡相关蛋白 synapsin，促进轴突生长和神经元的存活[21]，不同浓度的氯化钾均可诱导缺血脑组织的星形胶质细胞分泌的外泌体[21]。

体外培养的少突胶质细胞同样分泌外泌体，其外泌体的分泌受到细胞内钙水平调节。兴奋性神经元来源的谷氨酸刺激少突胶质细胞释放携带 MBP、PLP 和 sirtuin-2 的外泌体[22]，这些蛋白通过激活靶细胞 Rho/ROCK/myosin 受体的信号蛋白抑制髓鞘 形 成[23]。 透 射 电 镜 分 析 表明 ，在 轴 突 周 围 存 在 PLP+ 多 泡体[24]，表明外泌体有助于协调神经元介导的髓鞘形成[24]。少突胶质细胞来源的外泌体可以被神经元内化，从而提高神经元在细胞应激环境下的生存能力[22]。在脑缺血体外试验中，对大鼠皮质神经元进行氧/葡萄糖剥夺，少突胶质细胞来源的外泌体通过激活的超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和其他抗氧化酶，减少缺血性神经元死亡[25]。

原代培养的小胶质细胞和小胶质细胞细胞系释放的外泌体均含有氨肽酶 CD13 和乳酸转运单羧酸转运蛋白 1（monocarboxylate transporter 1，MCT-1）。 小 胶 质 细 胞 外 泌 体 可 以 转 移CD13至神经元，引起神经肽降解。小胶质细胞还可接收其他脑细胞分泌的外泌体。少突细胞祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）来源的外泌体优先被小胶质细胞通过大吞饮作用机制内化[26]。与初始小胶质细胞不同，被干扰素-γ（interferonγ，IFN-γ）刺激的小胶质细胞大幅减少对 OPCs来源的外泌体的吸收[26]。

6 MSC 来源的外泌体可能将应用于缺血性脑卒中的治疗

包括骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）在内的细胞疗法已被证明可改善卒中和脑外伤后神经功能。临床前研究表明，MSCs促进血管生成，神经发生和脑白质重塑，通过分泌因子触发参与脑修复的信号转导通路。

体外培养的MSCs分泌大量的外泌体，通过调节大脑微环境改善了卒中和脑外伤的治疗效果[27]。对局灶性脑缺血大鼠模型，静脉注射MSCs来源的外泌体后，极大促进血管重塑，神经功能的改善[27]。MSCs 来源外泌体的全身给药明显降低缺血小鼠运动协调障碍，增强血管和神经再生，而人类MSCs来源外泌体治疗脑创伤（traumatic brain injury，TBI）小鼠基本上保存其空间识别能力[28]。这些提示 MSCs介导的细胞间通讯的来源可能决定了MSCs的疗效。

外泌体把其装载的miRNA转移给受体细胞。MSCs来源的外泌体含有超过 700 种 miRNA，他们与 Argonaute2（Ago2）结合，形成miRNA 诱导的沉默复合体。MSCs来源外泌体所装载的特定miRNA水平对脑卒中后神经重塑的影响，已有体外和体内研究[27]。用 MSCs治疗卒中模型动物，可以消除缺血性脑卒中诱导的 miR-133b 的水平下调[27]。将 MSCs与缺血脑组织提取物混合培养，MSCs释放的 exosomes富含 miR-133b。慢病毒载体转染 MSCs来源的外泌体可上调或下调外泌体中miR-133b水平。结缔组织生长因子和 RhoA 是被 miR-133b 调控，并抑制轴突生长[27]。在体外，皮质神经元细胞与 miR-133b 上调的外泌体共培养，下调 RhoA 并促进轴突生长，星形胶质细胞与 miR-133b上调的外泌体共培养，则抑制结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表达。总之，MSCs来源的外泌体可作为载体输送miRNA至受体神经元和星形胶质细胞，从而调节其基因的表达。

卒中可抑制外周血免疫细胞的功能，导致卒中结局的恶化。除了与脑细胞之间的相互作用，MSCs来源的外泌体也可与卒中后小鼠外周血自然杀伤细胞和淋巴细胞进行相互作用，减轻缺血后免疫抑制[28]。

7 造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）来源的外泌体用于缺血性脑卒中的治疗

来自心肌缺血的研究表明，CD34+HSC来源的外泌体，经人工修饰富含音猬因子（sonic hedgehog，SHH），可转移功能化SHH至受体细胞并激活SHH信号通路，促进梗死边缘区血管生成和保护心脏功能[29]。这些实验表明，HSCs来源的外泌体，通过提供功能蛋白调节受体细胞的功能，很可能可促进脑卒中后的重塑。外泌体可穿越血脑屏障[30]。奥德赛 800 染料标记胶质母细胞瘤细胞分泌的外泌体并鼻腔给药，可观察到荧光颗粒分布于整个大脑，主要在小鼠嗅球[30]。利用 Cre-loxP 系统注射含Cre 重组酶 mRNA 的外泌体，至携带 ROSA26-lacZ 报告基因的小鼠海马，在海马神经元观察到 LacZ 报告基因激活[22]，表明含Cre重组酶的外泌体激活了受体神经元的报告基因。

8 展望

越来越多的数据表明，外泌体是卒中后神经修复和神经损伤活动中重要的细胞间介质，有利于患者功能的恢复[31]。但仍然存在许多问题和挑战：如需要明确卒中后脑组织及远处器官以何种途径来影响脑实质细胞外泌体的表达？外泌体装载的内容物通过何种途径来调节受体脑细胞的基因表达？不同脑实质细胞来源的外泌体其类型应如何划分？以及不同性别、年龄和合并症对外泌体及其装载的内容物有何影响？今后的研究，通过探讨外泌体作为缺血性脑细胞间的通讯介质，将有助于对卒中后神经功能修复机制的理解以及探索出基于外泌体的神经系统疾病的新疗法。

[1]Gyorgy B,Hung ME,Breakefield XO,et al.Therapeutic applications of extracellular vesicles:clinical promise and open questions[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2015,55:439-464.

[2]Miyamoto N,Pham LD,Seo JH,et al.Crosstalk between cerebral endothelium and oligodendrocyte[J].Cell Mol Life Sci,2014,71:1055-1066.

[3]Yin KJ,Hamblin M,Chen YE.Angiogenesis-regulating microRNAs and Ischemic Stroke[J].Curr Vasc Pharmacol,2015,13:352-365.

[4]Buller B,Chopp M,Ueno Y,et al.Regulation of serum response factor by miRNA-200 and miRNA-9 modulates oligodendrocyte progenitor cell differentiation[J].Glia,2012,60:1906-1914.

[5]Gherardini L,Gennaro M,Pizzorusso T.Perile-sional treatment with chondroitinase ABC and motor training promote functional recovery after stroke in rats[J].Cereb Cortex,2015,25:202-212.

[6]Zhang Y,Chopp M,Liu XS,et al.MicroRNAs in the axon locally mediate the effects of chondroitin sulfate proteoglycans and cGMP on axonal growth[J].Dev Neurobiol,2015,75:1402-1419.

[7]He X,Yu Y,Awatramani R,et al.Unwrapping myelination by microRNAs[J].Neuroscientist,2012,18:45-55.

[8]Haqqani AS,Delaney CE,Tremblay TL,et al.Method for isolation and molecular characterization of extracellular microvesicles released from brain endothelial cells[J].Fluids Barriers CNS,2013,10:4-9.

[9]Yamamoto S,Niida S,Azuma E,et al.Inflammation-induced endothelial cell-derived extracellular vesicles modulate the cellular status of pericytes[J].Sci Rep,2015,5:8505-8514.

[10]Schulz GB,Wieland E,Wüstehube-Lausch J,et al.Cerebral cavernous malforma-tion-1 protein controls DLL4-Notch3 signaling between the endothelium and pericytes[J].Stroke,2015,46:1337-1343.

[11]Sheldon H Heikamp E,Turley H,et al.New mechanism for Notch signaling to endothelium at a distance bylike 4 incorporation into exosomes [J].Blood,2010,116:2385-2394.

[12]Pan W.Exosomes derived from ischemic cerebral endothelial cells and neural progenitor cells enhance neurogenesis and angiogenesis[J]. Stroke,2016,47:AWMP39.

[13]Ihrie RA,Alvarez-Buylla A.Lake-front property:a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain[J].Neuron,2011,70:674-686.

[14]Feliciano DM,Zhang S,Nasrallah CM,et al.Embryonic cerebrospinal fluid nanoves-icles carry evolutionarily conserved molecules and promote neural stem cell amplification[J].PLoS One,2014,9:e88810.

[15]Cossetti C,Iraci N,Mercer TR,et al.Extracellular vesicles from neural stem cells transfer IFN-gamma via Ifngr1 to activate Stat1 signaling in target cells[J].Mol Cell,2014,56:193-204.

[16]Higa GS,de Sousa E,Walter LT,et al.MicroRNAs in neuronal communication[J].Mol Neurobiol,2014,49:1309-1326.

[17]Lachenal G,Pernet-Gallay K,Chivet M,et al.Release of exosomes from differentiated neurons and its regulation by synaptic glutamatergic activity[J].Mol Cell Neurosci,2011,46:409-418.

[18]Goncalves MB,Malmqvist T,Clarke E,et al.Neuronal RARβ signaling modulates PTEN activity directly in neurons and via exosome transfer in astrocytes to prevent glial scar formation and induce spinal cord regenera-tion[J].J Neurosci,2015,35:15731-15745.

[19]Morel L,Regan M,Higashimori H,et al.Neuronal exosomal miRNA-dependent translational regulation of astro-glial glutamate transporter GLT1 [J].J Biol Chem,2013,288:7105-7116.

[20]Clarkson AN,Overman JJ,Zhong S,et al.AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke[J].J Neurosci,2011,31:3766-3775.

[21]Wang S,Cesca F,Loers G,et al.Synapsin I is an oligomannose-carrying glycoprotein,acts as an oligomannose-binding lectin,and promotes neurite outgrowth and neuronal survival when released via glia-derived exosomes[J].J Neurosci,2011,31:7275-7290.

[22]Fruhbeis C,Fröhlich D,Kuo WP,et al.Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligoden-drocyte-neuron communication[J]. PLoS Biol,2013,11:e1001604.

[23]Bakhti M,Winter C,Simons M.Inhibition of myelin membrane sheath formation by oligo-dendrocyte-derived exosome-like vesicles[J].J Biol Chem,2011,286:787-796.

[24]Fruhbeis C,Frohlich D,Kuo WP,et al.Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication[J].Front Cell Neurosci,2013,7:182-189.

[25]Frohlich D,Kuo WP,Frühbeis C,et al.Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons:impact on neuronal firing rate,signal transduction and gene regulation[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2014,369:2013510.

[26]Fitzner D,Schnaars M,van Rossum D,et al.Selective transfer of exosomes from oligodendrocytes to microglia by macropi-nocytosis[J].J Cell Sci,2011,124:447-458.

[27]Xin H,Li Y,Liu Z,et al.MiR-133b promotes neural plasticity and functional recovery after treatment of stroke with multipotent mesenchymal stromal cells in rats via transfer of exosome-enriched extracellular particles[J].Stem Cells,2013,31:2737-2746.

[28]Doeppner TR,Herz J,Görgens A,et al.Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression[J].Stem Cells Transl Med,2015,4:1131-1143.

[29]Mackie AR,Klyachko E,Thorne T,et al.Sonic hedgehog-modified human CD34+cells preserve cardiac function after acute myocardial infarction[J].Circ Res,2012,111:312-321.

[30]Zhuang X,Xiang X,Grizzle W,et al.Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain[J].Mol Ther,2011,19:1769-1779.

[31]Ueno Y,Chopp M,Zhang L,et al.Axonal outgrowth and dendritic plas-ticity in the cortical peri-infarct area after experi-mental stroke[J]. Stroke,2012,43:2221-2228.

（本文编辑：唐颖馨）

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.014

复旦附属浦东医院/上海市浦东医院a.急诊内科；b.全科医学科；c.内分泌科上海 201399

2017-02-10

萧文泽wenzexiao@yahoo. com

注：瞿笑丰和陈丽欣为并列第一作者