湘南地区煤矿从业人员结核病流行菌株及耐药情况分析

王立亚415000湖南省常德市武陵区疾病预防控制中心

湘南地区煤矿从业人员结核病流行菌株及耐药情况分析

王立亚
415000湖南省常德市武陵区疾病预防控制中心

目的：调查湘南地区煤矿从业人员结核病患病及结核分枝杆菌流行和耐药情况，为煤矿从业人员结核病的防治提供依据。方法：收集本地区确诊的有煤矿从业史(≥1年)的结核病患者痰液标本，分离培养和抗结核药物耐药性检测。结果：共收集痰标本436份，镜检阳性率为39.91%，培养阳性率25.92%，耐药率25.66%。初治病例组镜检和培养阳性率均高于复治病例组，单耐药及多耐药率均低于复治病例组。结论：本地区煤矿从业人员结核病以北京基因型结核分枝杆菌感染为主，且复治病例耐药率明显高于初治病例，应加强对煤矿从业人群的结核病防控。

结核分枝杆菌；耐药性；煤矿从业人员；北京基因型

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)引起的严重危害人类健康的慢性传染性疾病，已经成为当前不容忽视的公共卫生问题。2010年中国新发现结核病例91万例，占当年全球总发病人数的1/6[1]，并且由于未进行大规模的长期、规范、系统的治疗，导致耐药和耐多药结核不断出现。我国2007-2008年的结核病耐药基线调查结果显示，全国结核病耐多药率8.32%，广泛耐药率0.68%[2]。煤矿从业人员是一类特殊的人群，由于其工作环境的特殊性，导致其成为结核分枝杆菌感染的易感人群。本研究拟通过调查本地区煤矿从业人员的结核病患病及耐药情况分析，为煤矿从业人员这一特定人群的结核病防治提供依据。

资料与方法

选取在常德市和益阳市各级疾病预防控制中心登记在册的有煤矿从业史(≥1年)的结核病患者进行回访并采集痰液样本，研究对象均为男性，年龄19～65岁，平均41.3岁。所有调查对象留取清晨由肺部深处咳出的痰进行萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色，剩余部分加入4%氢氧化钠，并接种于酸性罗氏培养基上。

主要试剂与仪器：4种一线抗结核药物：异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)。分枝杆菌分离培养基及药敏实验培养基(7H9液体培养基)由本实验室自行配制。Tap DNA聚合酶、dNTP、引物购自北京天根生物科技公司，TGRADINENT PCR仪、微量凝胶电泳系统购自美国Bio-RAD公司。

分枝杆菌分离培养及药敏实验：临床分离培养的结核分枝杆菌转种于含各种抗结核药物的药敏培养基上。药物敏感试验采用绝对浓度法。将酸性罗氏培养基中培养出来的结核分枝杆菌加入0.5%吐温-80生理盐水中，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)对比，得到1 mg/mL的菌液。静置片刻后用刻度吸管将菌液上清逐步稀释至10～2 mg/mL和10～4 mg/mL。用22 SWG标准接种环分别蘸取1满环，划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，接种置于37℃恒温箱培养4周后观察结果。

结核分枝杆菌总DNA提取：采用热裂解法提取总DNA，从分离培养基上刮取适量菌体溶于蒸馏水，漩涡振荡器上振荡使菌落溶解均匀。于80℃灭活30 min，8 000 r/min离心。弃上清后加400 μL TE混悬后，煮沸30 min，离心后上清即为结核分枝杆菌DNA，分装于EP管中，-20℃保存备用。

分离菌株的鉴定：采用RD105缺失基因检测法鉴定“北京家族”菌株，上游引物F：5'-CGTGCA CAGTTGCGTGTGTA-3'； 下 游 引 物 R： 5'-CGTCGTATTCTGCCGATACT-3′。PCR扩增片段长度266 bp。PCR反应体系：Tap DNA聚合酶0.5 μL，dNTP 2.0 μL(2.5 mmol/L)，引物各5 pmol，DNA 5.0 μL，10×PCRBuffer 2.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，70℃45 s，共30个循环；最后68℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测阳性说明菌株存在RD105基因缺失则鉴定为“北京家族”菌株。

表3 初治与复治病例的耐药情况分析[n(%)]

表4 北京基因型与非北京基因型的耐药情况分析[n(%)]

结果

结核分枝杆菌分离培养及基因型鉴定：共收集436份痰标本，其中初治病例标本128份，复治病例标本308份，染色后镜检阳性标本174份，镜检阳性率39.91%(174/436)，分离得到113株结核分枝杆菌。培养阳性率25.92%(113/436)，RD105基因缺失法检测出北京基因型菌株72株(PCR检测阳性)，占63.72%(72/ 113)，见表1。

结核分枝杆菌临床分离株对一线抗结核药物的耐药情况：分离培养得到113株结核分枝杆菌，对一种抗结核药物具有耐药性29株，其中耐异烟肼(H)12株、耐利福平(R)8株、耐链霉素(S)5株、耐乙胺丁醇(E)4株，对单一抗结核药物耐药率分别为 H 10.62%、R 7.08%、S 4.42%、E 3.54%，总耐药率25.66%。对两种及以上耐药8株，耐多药率7.08%(8/ 113)，见表2。

表1 结核病患者痰标本镜检和培养阳性率及临床分离菌株基因型分析[n(%)]

表2 结核分枝杆菌临床分离株对一线抗结核药耐药情况

结核病初治与复治病例耐药情况分析：本研究共培养出结核分枝杆菌178株，其中初治病例单耐药率和多重耐药率分别为14.49%(10/69)和1.45%(1/69)，复治病例单耐药率和多重耐药率分别为43.18%(19/44)和15.91%(7/44)，初治病例和复治病例在单耐药和多重耐药率之间比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

结核分枝杆菌北京基因型与非北京基因型耐药情况分析：本研究培养出的113株结核分枝杆菌中，北京基因型菌株单耐药率和多重耐药率分别为33.33% (24/72)和9.72%(7/72)，非北京基因菌株单耐药和多重耐药率分别为12.2%(5/41) 和2.44%(1/41)，两者之间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

讨论

结核分枝杆菌是一种胞内寄生的致病菌，由于其细胞壁包有丰富的脂质，并含有多种编码调控突变性、潜伏性、持留性及致病性等特征的基因[3]，故长期潜伏于宿主体内，对宿主造成长期、慢性损伤[4，5]。目前临床上对结核病的诊断主要依靠临床症状和影像学，结核分枝杆菌的分离培养由于周期长、阳性率低，不能满足临床需求并容易导致患者漏诊而延误治疗。本研究中在确诊的结核病例中痰培养阳性率25.92%，且复治病例痰培养阳性率仅14.29%。结核病初治病例在镜检和培养阳性率明显高于复治病例，药敏实验分析发现复治病例的单药和多药耐药率明显高于初治病例。复治病例由于没有规范、长期、按时、足量地进行抗结核治疗导致耐药情况严峻。

根据不同分型技术的研究结果：目前全世界流行的结核病主要是由几种特殊的结核分枝杆菌引起的，并且不同的基因家族具有不同的分子特征、地区性分布和致病性。北京基因型菌株具有更强的毒力、传播力，且与耐药性有关，因此对“北京家族”菌株的鉴定和研究将对结核杆菌的传播规律、耐药性等生物学特征的研究产生重要意义[6，7]。本研究中发现煤矿从业人员结核分枝杆菌北京基因型占所有分离菌株的63.72%，耐药情况分析发现北京基因型的单药和多药耐药率明显高于非北京基因型菌株。说明在煤矿从业人员中结核分枝杆菌北京基因型是主要流行的菌株，并且其耐药率要远远高于非北京基因型菌株。

本研究中所有病例均有过煤矿从业史，由于其特殊的相当封闭的工作环境，导致煤矿从业人员的尘肺和肺结核的发病率要明显高于普通人群。并且由于职业疾病的存在(尘肺、矽肺等)加上经济因素的影响[8]，导致煤矿从业人员结核病的治疗效果不佳而出现耐药率明显增加的情况。应加强对煤矿从业人员结核病防治的管理，严格控制耐药菌株的出现，尤其是要重点监控复治患者的管理。

[1] Dirlikov E,Raviglione M,Scano F.Global Tuberculosis Control:Toward the 2015 Targets and Beyond[J].Ann Intern Med,2015,163(1): 52-58.

[2] World Health Organization.Global tuberculosis control and patient care:a ministerial meeting of high M/XDR-TB burden countries[R].Beijing,2009.

[3] Pavlicek RL,Fine-Coulson K,Gupta T,et al. Rv3351c,a Mycobacterium tuberculosis gene that affects bacterial growth and alveolar epithelial cell viability[J].Can J Microbiol, 2015,61(12):938-947.

[4] Sun Y,Harley D,Vally H,et al.Comparison ofcharacteristics and mortality in multidrug resist ant(MDR)and non-MDR tuberculosis patients in China[J].BMC Public Health, 2015,15:1027.

[5] Braian C,Svensson M,Brighenti S,et al.A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection[J].J Vis Exp,2015,104:113-115.

[6] Anon.European concerted action on new generation genetic markers and techniques for the epidemiology and control of tuberculosis[J].Emerg Infect Dis,2006,12(5):736-743.

[7] 吴长东,米利古,龚天美,等.RD105缺失基因检测法用于结核分枝杆菌新疆“北京家族”临床分离株的鉴定[J].中国病原生物学杂志,2010,5(3):161-164.

[8] 马英华,邵华,崔萍,等.2014年山东省部分煤矿井下作业工人尘肺结核患病情况调查[J].预防医学论坛,2015,21(3):172-175.

Analysis on TB epidemic strains and drug resistance of coal mine employees in southern Hunan

Wang Liya
Wuling District Center for Disease Control and Prevention,Changde City of Hunan Province 415000

Objective:To investigate the prevalence of TB among southern Hunan coal mine workers,and mycobacterium tuberculosis epidemic and drug resistance,in order to provide a basis for prevention and treatment on tuberculosis of the coal mine employees.Methods:Tuberculosis sputum specimens with region's diagnosis in coal mine employment history(more than 1 years) were collected,then we detected and isolation of anti tuberculosis drug resistance.Results:A total of 436 sputum samples were collected.The positive rate of microscopic examination was 39.91%;the positive rate of culture was 25.92%;the rate of drug resistance was 25.66%.The positive rate of microscopic examination and culture in the primary cases group were higher than those in the retreatment group,and the rate of single drug resistance and multidrug resistance also lower than those in the retreatment group.Conclusion:Beijing genotype of mycobacterium tuberculosis infection was the main type among local coal mine workers with tuberculosis,and drug resistance rate in the retreatment group was significantly higher than in the primary cases group,so TB prevention and control should be strengthen among coal mine workers.

Mycobacterium tuberculosis;Drug resistance;Coal mine workers;Beijing genotype

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.4.4