miR-24对人脐静脉内皮细胞增殖、转移及自噬的影响

杨鹏，罗雪兰，莫国君，陶晓静，沈凤，欧和生( 广西医科大学药学院，南宁530021)

miR-24对人脐静脉内皮细胞增殖、转移及自噬的影响

杨鹏，罗雪兰，莫国君，陶晓静，沈凤，欧和生
( 广西医科大学药学院，南宁530021)

目的 探讨miR-24对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、转移、自噬的影响。方法 将HUVECs随机分为空白对照组、雷帕霉素+miR-24高表达组、雷帕霉素组。空白对照组不给予任何处理；雷帕霉素组的HUVECs用1 000 nmol/L雷帕霉素处理6 h建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表达组的HUVECs先转染miR-24高表达质粒，待转染成功后以同样方法建立自噬模型；用CCK-8法检测HUVECs增殖能力，细胞划痕试验检验细胞的转移能力，进一步用免疫组织化学和 Western blotting 法检测HUVECs自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Beclin-1的蛋白表达水平，采用透射电镜观察细胞内部自噬小体。结果 与空白对照组相比，雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组OD值、细胞迁移比例降低、Beclin-1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表达量上升(P<0.01或<0.05)。与雷帕霉素组相比，雷帕霉素+miR-24高表达组OD值、细胞迁移比例下降，Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达量下降(P<0.01或<0.05)。透射电镜观察结果显示，空白对照组和雷帕霉素+miR-24高表达组的细胞质内各细胞器分布基本正常，细胞核形态也正常，细胞质中未见明显自噬小体；雷帕霉素组细胞质中可见明显的空泡状结构、包含部分双层膜结构的自噬小体。结论 miR-24可显著抑制HUVECs的增殖、转移及自噬。

人脐静脉内皮细胞；miRNA-24；细胞自噬；细胞增殖

miRNAs是一类高度保守的内源性非编码单链小分子RNA，长19～22个核苷酸，其通过作用于靶基因的3′UTR区域来调控靶基因mRNA降解或翻译，是一种在转录后水平对基因进行调控的方式[1]。在血管内皮细胞特异性表达的miRNAs,通过参与血管内皮细胞分化、增殖、迁移、成管与凋亡等调控血管新生的过程，且这些miRNAs的表达异常在血管新生及相关疾病的发生、发展中发挥着重要作用[2，3]。内皮细胞自噬与血管疾病的生理病理过程有高度相关性。Nishikawa等[4]研究发现，通过诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬，能促进血管内皮细胞增殖，从而促进血管新生。研究发现,一些miRNAs可以通过调控与自噬相关的微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Beclin-1蛋白的表达，从而发挥对自噬的调节作用[5，6]。最新研究表明，miR-24能显著抑制血管内皮细胞增殖[7]，然而，miR-24在抑制血管内皮细胞增殖的过程中是否涉及对自噬水平的调控鲜有文献报道。2015年7月～2016年7月，本研究探讨了miR-24在抑制血管内皮细胞增殖的过程中对细胞自噬水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVECs(Procell，中国武汉)；1640细胞培养基(Gibco，上海立菲生物技术有限公司)；胎牛血清(Gibco，澳洲)；载体miRNASelectTMpEGP-miR(Cell Biolabs)；X-tremeGENE HP DNA 转染试剂盒(Roche，德国 )；人工基底膜 (Matrigel)(Corning，美国)；质粒提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；内参β-actin抗体(广州晶欣生物科技有限公司)；LC3,HIF-1α,BNIP3和 Beclin1抗体(Cell Signaling，美国)；蛋白电泳仪、蛋白质转膜仪(Bio-Rad，美国)；Odyssey红外荧光扫描成像系统(LICOR，美国)；透射电子显微镜(日立 H7650，日本)。

1.2 miR-24高表达质粒的构建及鉴定 miR-24序列(来自http://www.miRbase.org)为 5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′;首先通过DNA合成技术得到第1 链DNA，然后再利用DNA 连接反应合成相应的双链 DNA，通过PCR扩增后和体外重组，最后插入 pEGP-miR 载体转化入E.coli DH 5α感受态宿主菌，选取经酶切初步证实并插入正确的单克隆菌落，然后提取质粒DNA寄往上海生工测定 DNA 序列。

1.3 HUVECs的培养和转染 HUVECs用含有100 mg/L链霉素、1×105U/L青霉素、10%胎牛血清的1640培养基培养，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中。提取的质粒用NANO核酸测定仪测定浓度，重复3次，取平均值。然后使用无血清 1640 培养基将质粒稀释至浓度为0.01 μg/μL，并将 X-tremeGENE HP DNA 转染试剂与质粒按3 μL∶1 μg比例混合，取生长正常的 HUVECs 孵育，24 h 后更换含10%胎牛血清1640培养基，培养24 h观察免疫荧光。

1.4 细胞分组以及HUVECs自噬模型的建立 将实验细胞随机分为3组：空白对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组。空白对照组不给于任何处理；雷帕霉素组建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表达组的HUVECs待miR-24高表达质粒转染成功后，建立自噬模型。根据文献[8]实验步骤，采用HUVECs经1 000 nmol/L雷帕霉素处理6 h建立自噬模型。

1.5 HUVECs增殖活力的检测 采用CCK-8法。96孔板每孔加入细胞密度为5×103/mL细胞悬液100 μL，每组设置3个复孔，在37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h使其贴壁，各组细胞按设定条件处理后，每孔加入CCK-8试剂10 μL,培养箱避光孵育1 h，用酶标仪检测450 nm波长处光密度(OD)值，试验重复3次。

1.6 HUVECs转移能力的检测 采用细胞划痕试验。取对数生长期HUVECs配制成单细胞悬液，调整细胞密度为每孔5×104/mL，接种于24孔板，待细胞贴壁、生长成单细胞层时，用200 μL枪头于板孔底面中轴划“一”道划痕，用PBS洗涤3次，然后加入无血清1640培养基继续培养。分别于0 h和24 h显微镜下观察细胞迁移情况并测量划痕宽度，迁移比例 =(划痕 0 h 后划痕宽度-划痕 24 h 后划痕宽度)/ 划痕 0 h 后划痕宽度，实验重复 3 次。

1.7 HUVECs内自噬小体的观察 利用透射电镜法。将固定液存放于4 ℃冰箱；将各组实验细胞分别消化，然后分别用15 mL离心管离心(800 r/min，5 min)；倒掉上清，加PBS 1 mL到离心管中，混悬；然后把混悬液吸入一个洁净的EP管中，低温离心(约5 000 r/min，15 min)，弃上清，加入固定液1 mL，送电镜室观察。

1.8 HUVECs内Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白表达的检测 ①采用免疫组化法检测。将无菌玻片放入24孔板，加入细胞(每孔2×104个HUVECs)培养24 h，转染并造模成功后取爬片，PBS冲洗3次，中性树脂粘片，4%甲醛固定。用TritonX-100(10 min)和3%过氧化氢(30 min)处理后双蒸水冲洗3次，敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后显色剂显色。Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白表达于胞质，Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白的表达以棕黄色作为阳性判断标准。②采用Western blotting 法检测。将各组细胞裂解，12 000 r/min、4 ℃离心 15 min，取上清。各实验组分别取蛋白 30 μg进行 SDS-PAGE(8%)分离并转至PVDF膜上，然后加入Beclin-1和LC3Ⅰ抗孵育过夜(4 ℃) 。TBST冲洗3次(每次15 min)，加入Ⅱ抗孵育，1 h后重复用TBST避光冲洗(方法同上)。利用LICOR公司的Odyssey红外荧光扫描成像系统分析蛋白电泳条带的灰度值，计算Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白的表达量。以β-actin为内参，Beclin-1或LC3Ⅱ的相对表达量=Beclin-1或LC3Ⅱ灰度值/β-actin灰度值。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组HUVECs的增殖活力比较 空白对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组的OD值分别为1.28±0.03、0.87±0.01、0.47±0.01，与空白对照组相比，雷帕霉素+miR-24高表达组OD值降低63.45%(P<0.01),雷帕霉素组OD值降低32.62%(P<0.01)。与雷帕霉素组相比，雷帕霉素+miR-24高表达组OD值降低45.96%(P<0.01)。

2.2 各组HUVECs的转移情况 空白对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组HUVECs的迁移比例分别为0.33±0.40、0.18±0.15、0.09±0.32，与空白对照组比较，划痕24 h后雷帕霉素+miR-24高表达组HUVECs的迁移比例降低72.72%(P<0.05)，雷帕霉素组的迁移比例降低45.46%(P<0.05)。与雷帕霉素组相比，雷帕霉素+miR-24高表达组HUVEC的迁移比例下降了50.00%(P<0.05)。

2.3 各组HUVECs的超微结构 透射电镜观察结果显示，空白对照组和雷帕霉素+miR-24高表达组的细胞质内各细胞器分布基本正常，细胞核形态也正常，细胞质中未见明显自噬小体；雷帕霉素组细胞质中可见明显的空泡状结构、包含部分双层膜结构的自噬小体。

2.4 各组HUVECs Beclin-1蛋白表达比较 Beclin-1蛋白表达量以雷帕霉素组最高，雷帕霉素+miR-24高表达组的表达较少，而对照组则基本没有表达。空白对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组Beclin-1蛋白表达分别为0.03±0.02、0.26±0.01、0.09±0.01，与空白对照组比较，雷帕霉素组的Beclin-1蛋白表达量上升了766.67%(P<0.05)，雷帕霉素+miR-24高表达组上升了200.00%(P<0.05)；与雷帕霉素组比较，雷帕霉素+miR-24高表达组下降了65.38%(P<0.05)。

2.5 各组HUVECs LC3Ⅱ蛋白表达比较 雷帕霉素组LC3 Ⅱ蛋白表达量最高，雷帕霉素+miR-24高表达组的表达较少，而空白对照组基本没有表达。空白对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+miR-24高表达组LC3 Ⅱ蛋白表达量分别为0.05±0.01、0.48±0.01、0.15±0.02，与空白对照组比较，雷帕霉素组LC3 Ⅱ蛋白表达量上调了860.00%(P<0.05)；雷帕霉素+miR-24高表达组上调了200.00%(P<0.05)；与雷帕霉素组比较，雷帕霉素+miR-24高表达组蛋白表达量下调了68.75%(P<0.05)。

3 讨论

miRNAs是一类长19～22 nt的内源性单链小分子非编码RNA，近年越来越多的证据显示，miRNA在细胞分化、增殖、迁移和凋亡等过程中起着关键作用。miRNA在众多人类疾病，如血管疾病和癌症以及糖尿病等疾病的发生发展过程中发挥着重要作用[8]。例如，miR-126在内皮细胞中特异性表达，并参与内皮细胞生物合成、血管发育及维持血管完整性等生理过程[9]。

自噬普遍存在于绝大多数真核生物中，细胞自噬是一种利用溶酶体对自身受损蛋白质和细胞器进行降解，从而为细胞提供能量和原料来维持自身代谢平衡的高度保守的细胞降解过程。当细胞处于氧化应激或辐射等环境中时，自噬可能会被诱发，一定程度的自噬对细胞具有保护作用[10]；但是，当自噬不足或自噬过度则会使细胞内环境稳态失调从而损伤细胞，甚至导致细胞死亡[11]。许多心血管疾病的发生发展都与细胞自噬程度的变化有关。例如在心力衰竭过程中，适度的自噬对心肌细胞有保护作用，而过度自噬则会导致心肌细胞死亡，并可能会使心力衰竭进一步恶化[12]。近年研究发现，有些miRNAs通过调控自噬相关基因表达，参与自噬过程的调节，在心血管疾病发生发展过程中发挥重要作用。Jian等[13]发现，心肌细胞在缺氧复氧情况下诱发自噬时，miR-204可以通过下调LC3Ⅱ抑制自噬的进程，进而保护心肌细胞，使其免于缺氧复氧造成的损伤。Small等[14]发现，在小鼠缺血再灌注心肌中，miRNA-30表达量明显减少。自噬相关基因Beclin-1是miRNA-30的直接作用靶点，通过上调细胞自噬水平可影响内源性miRNA-30表达。因此，miRNA-30是通过下调Beclin-1表达，进而抑制自噬形成。

血管内皮细胞是机体内的一种重要细胞，血管内皮细胞增殖与众多心血管疾病的生理病理过程密切相关[15，16]。研究表明，miRNA的特异性改变参与了心血管疾病的发生发展进程。因此，miRNA是否对血管内皮细胞的自噬水平有调节作用，以及是否对血管内皮细胞的生理功能产生影响，是一个重要的研究课题。本研究通过透射电镜观察发现，经雷帕霉素处理后，HUVECs 胞质中可见明显的自噬小体，与文献[17]中描述的自噬体结构一致，而经miR-24+雷帕霉素处理的HUVECs 胞质中并未发现明显的自噬小体结构。LC3Ⅱ和Beclin-1是自噬的相关基因，参与了自噬小体的形成，且细胞中LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达量与自噬发生的程度密切相关。本试验免疫组化和Western blotting结果显示，经雷帕霉素处理的HUVECs，与空白对照组相比，细胞中LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达量均增多，而雷帕霉素+miR-24高表达组的HUVECs内LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达量明显少于雷帕霉素组，提示miR-24可抑制自噬相关基因LC3Ⅱ和Beclin-1的表达。同时CCK-8法和划痕试验结果表明，miR-24能显著抑制HUVECs的增殖。提示miR-24有可能是通过抑制LC3 Ⅱ和Beclin-1基因的表达，进而降低HUVECs的自噬水平，最终导致HUVECs的增殖受到抑制。但是血管内皮细胞增殖的过程受多种因素调节，其机制不仅仅是受单一分子或基因所调控，所以其具体的分子机制仍不清楚，有待进一步研究。

本文通过研究miR-24对自噬相关基因LC3Ⅱ和Beclin-1的表达及血管内皮细胞增殖的影响，主要有以下发现：第一，miR-24对调控LC3Ⅱ蛋白和Beclin-1蛋白的表达具有明显的调节作用；第二，miR-24抑制LC3 Ⅱ和Beclin-1表达的同时，也抑制血管内皮细胞的增殖、转移；第三，miR-24很有可能是通过调控LC3Ⅱ和Beclin-1表达，进而抑制血管内皮细胞增殖、转移。

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Effects of miR-24 on cell proliferation, metastasis and autophagy of HUVECs

YANGPeng,LUOXuelan,MOGuojun,TAOXiaojingSHENFeng,OUHesheng

(CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of miR-24 on the cell proliferation, metastasis and autophagy of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were randomly divided into the blank control group, rapamycin + miR-24 high expression group and rapamycin group. The control group was not treated. HUVECs in the rapamycin group were treated with 1000 nmol/L rapamycin for 6 h to establish an autophagic model. HUVECs in the rapamycin + miR-24 high expression group were transfected with miR-24 high expression plasmid. After successful transfection, the cells were treated with 1 000 nmol/L rapamycin for 6 h to establish the autophagic models. The proliferation ability of HUVECs was detected by CCK-8, and the cell migration ability was measured by cell scratch test, the protein expression levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and Beclin-1 in HUVECs were detected by immunohistochemistry and Western blotting. The autophagic bodies were observed by transmission electron microscopy.Results Compared with the blank control group, the OD value and migration ratio of the rapamycin group and the rapamycin + miR-24 high expression group were decreased and the expression of Beclin-1 protein and LC3 II protein was increased (P<0.01 orP<0.05). Compared with the rapamycin group, the OD value and migration ratio of the rapamycin + miR-24 high expression group were decreased, and the expression of Beclin-1 and LC3 II protein was decreased (P<0.01 orP<0.05). The results of transmission electron microscopy showed that the distribution of each organelle in the cytoplasm of the blank control group and the rapamycin + miR-24 high expression group was normal, the nucleus morphology was normal and the autophagic bodies were not found in the cytoplasm. In the the rapamycin group, the obvious vacuolar structure and the autophagosome containing part of the bilayer structure conld be seen in the cytoplasm.Conclusion miR-24 significantly inhibits the proliferation, metastasis and autophagy of HUVECs.

human umbilical vein endothelial cells; miRNA-24; cell autophagy; cell proliferation

国家自然科学基金资助项目( 81373403)。

杨鹏(1991-),男，硕士研究生，主要研究方向为心血管分子药理学。E-mail:475394354@qq.com

欧和生(1965-),男，博士生导师，主要研究方向为心血管分子药理学。E-mail:hsou01@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.007

R34

A

1002-266X(2017)13-0024-04

2017-02-13)