甲状腺乳头状癌患者的癌组织、血浆中长链非编码RNA NONHSAT037832表达观察

孙爱军，斯岩，刘指南，蔡晶昇，沈美萍

(1 南京医科大学第一附属医院，南京210029；2徐州医科大学附属淮安医院，淮安市第二人民医院)

甲状腺乳头状癌患者的癌组织、血浆中长链非编码RNA NONHSAT037832表达观察

孙爱军1,2，斯岩1，刘指南1，蔡晶昇1，沈美萍1

(1 南京医科大学第一附属医院，南京210029；2徐州医科大学附属淮安医院，淮安市第二人民医院)

目的 观察甲状腺乳头状癌患者的癌(PTC)组织、血浆中长链非编码RNA (LncRNA) NONHSAT037832的表达变化。方法 58例PTC患者(PTC组)，其中伴有侧颈区淋巴结转移38例，不伴有侧颈区淋巴结转移20例，均行PTC切除手术，术前留取外周静脉血分离血浆，术中留取PTC组织标本。25例甲状腺腺瘤患者为对照组，术前留取外周静脉血分离血浆，术中留取甲状腺腺瘤组织标本。采用RT-PCR法检测两组PTC组织、血浆NONHSAT037832。结果 PTC组、对照组瘤组织NONHSAT037832的相对表达量分别为2.81±0.63、3.04±0.56，血浆NONHSAT037832的相对表达量分别为4.02±1.38、4.16±1.43，二者比较，P均>0.05。PTC组中侧颈区淋巴结转移、无淋巴结转移者瘤组织NONHSAT037832的相对表达量分别为2.51±0.63、8.74±1.56，血浆NONHSAT037832的相对表达量分别为8.54±1.55、2.42±0.38，二者比较，P均<0.05。相关性分析显示 PTC患者癌组织NONHSAT037832与血浆中NONHSAT037832表达呈正相关(r=0.882，P<0.001)。结论 PTC癌组织NONHSAT037832表达与血浆NONHSAT037832表达呈正相关，PTC伴侧颈区淋巴结转移患者血浆NONHSAT037832水平降低。

甲状腺肿瘤；甲状腺乳头状癌；长链非编码RNA; 长链非编码RNA NONHSAT037832；

甲状腺乳头状癌(PTC)是最常见的甲状腺癌类型，占甲状腺癌的80%～90%[1，2]。长链非编码RNA (LncRNA)是一类长度大于200 bps的非编码多聚腺苷酸，不编码蛋白质，主要由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，其表达具有组织特异性[3，4]。目前LncRNAs已经成为基因表达调控水平的关键性调节分子。多种癌组织中可见LncRNAs特征性的表达异常[5]。NONHSAT037832是一种新发现的LncRNAs，目前关于NONHSAT037832在PTCA组织肿的表达报道较少。我们观察了PTC患者的癌组织、血浆中NONHSAT037832的表达变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2015年6月～2016年6月间在南京医科大学第一附属医院甲状腺外科住院的PTC患者58例(PTC组)，其中男12例、女46例，年龄(45.23±14.14)岁；肿瘤直径(12.56±7.45)mm；其中伴有伴侧颈区淋巴结转移者38例，不伴有伴侧颈区淋巴结转移中的20例；均行PTC切除手术，术后病理确诊为PTC；术前留取外周静脉血分离血浆，术中留取PTC组织。排除既往存在甲状腺手术史、术前接受过放疗或化疗者、哺乳期妇女、存在严重心肺疾病及肝肾功能衰竭、患有其他恶性肿瘤者。另选择25例甲状腺腺瘤患者为对照组，其中男8例、女17例，年龄(47.54±15.26)岁；腺瘤直径(28.4±10.23)mm；均行甲状腺腺瘤切除术，术前留取外周静脉血分离血浆，术中留取甲状腺腺瘤组织。所有标本经液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存备用。两组性别、年龄比例等临床资料具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 两组PTC组织、血浆NONHSAT037832检测 总RNA提取分离试剂盒(北京天根生化科技公司)，RT反转录试剂盒、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(TaKaRa生物，中国)，NanoDrop 2000c紫外分光光度仪(美国赛默飞世尔公司)，7500 Fast型qRT-PCR仪(ABI公司，美国)。采用RT-PCR法。取两组PTC组织、血浆，严格按照RNA提取分离试剂盒说明书操作步骤提取PTC组织、血浆LncRNA。用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度和纯度。选取A260 nm/A280 nm在1.8～2.2的样品用于后续试验。以GAPDH作为内参。所有引物均由TaKaRa生物(大连，中国)合成。NONHSAT037832上游引物序列为5′-GCCAATGTCACCATGCACTC-3′，下游引物序列为5′-GCTGAGAGAACGTCAGCTCC-3′；GAPDH上游引物序列5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。总反应体系20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM(2x) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L)0.4 μL,PCR Reverse primer(10 μmol/L)0.4 μL, ROX Reference Dye(50x) 0.4 μL， cDNA模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。扩增条件为95 ℃，5 s；60 ℃，45 s，共40个循环。用7500 Fast System SDS 软件计算Ct值。用2-ΔΔCt法表示NONHSAT037832的相对表达两。重复3次，取平均值。

2 结果

PTC组、对照组瘤组织NONHSAT037832的相对表达量分别为2.81±0.63、3.04±0.56，二者比较，P>0.05； PTC组、对照组血浆NONHSAT037832的相对表达量分别为4.02±1.38、4.16±1.43，二者比较，P>0.05。PTC组中淋巴结转移者、无淋巴结转移者瘤组织NONHSAT037832的相对表达量分别为2.51±0.63、8.74±1.56，二者比较，P<0.05；PTC组中淋巴结转移者、无淋巴结转移者血浆NONHSAT037832的相对表达量分别为8.54±1.55、2.42±0.38，二者比较，P<0.05。

相关性分析显示 PTC患者癌组织NONHSAT037832与血浆中NONHSAT037832表达呈正相关关(r=0.882，P<0.001)。

3 讨论

近年，甲状腺癌发病率逐年升高，且呈年轻化趋势[2]。PTC是最常见的甲状腺癌，易发生肿瘤转移[3]。据报道30%～90%的甲状腺癌患者会出现颈部淋巴结转移，且发生淋巴结转移的患者预后常较差[4～6]。此外，甲状腺癌复发转移的主要器官就是淋巴结，局部复发率高达31%[5]。因此猜测，部分甲状腺癌患者在肿瘤发现进行手术时已出现淋巴结转移，但早期淋巴结转移并未被临床发现。转移淋巴结的早发现、早治疗有助于降低甲状腺癌切除术患者术后肿瘤复发率及病死率。目前超声引导下的细针穿刺被广泛用来检测甲状腺原发癌、转移灶及复发灶[7]。但临床中约有30%的细针穿刺报告显示为“不确定性”。临床上主要应用超声、CT、FDG-PET/CT来发现转移灶及复发灶，但是这些准确率较低且费用高[8,9]。因此，找到新的生物标志物来预测甲状腺淋巴结转移具有重要临床意义。分子标志物已经成功应用于许多疾病的诊断和判断预后的工具[10]。90%的哺乳动物基因组表达非编码RNAs(ncRNA)，这些RNA转录但不翻译成蛋白质。miRNA和LncRNA是ncRNA的两种类型，这些RNA的异常表达在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[11]。许多miRNA已经作为与PTC淋巴结转移相关的生物标志，如miRNA2861、miRNA451；miRNA146b、miRNA221、miRNA222及miRNA-135b可作作为PTC侵袭性相关的标志[12]。近来许多研究表明LncRNAs在肿瘤发生与转移方面扮演重要作用，如CUDR、LSINCT-5、PTENP1是胃癌诊断的潜在标志物[13]。POU3F3对鳞状食管癌具有较高的诊断价值[14]。由于LncRNA片段大于200 bp，所以临床一直对其在外周血中的循环稳定性存在质疑，但近来已有相关文献[1]报道其在循环血中稳定存在，可能作为新的特异性肿瘤生物标志物。已有学者研究发现，LncRNA NONHSAT037832在甲状腺乳头状癌组织中表达较癌旁组织中表达显著降低，且其水平降低与淋巴结转移及肿瘤大小呈负相关[15]。本研究发现，PTC组瘤组织、血浆中NONHSAT037832的相对表达量低于对照组，但差异无统计学意义， PTC组中淋巴结转移者癌组织、血浆NONHSAT037832的相对表达量均低于无淋巴结转移者，且相关性分析显示 PTC患者癌组织NONHSAT037832与血浆中NONHSAT037832表达呈正相关，说明血浆NONHSAT037832可作为筛选PTC患者伴淋巴结转移的潜在血浆学指标。

综上所述，PTC癌组织NONHSAT037832表达与血浆NONHSAT037832表达呈正相关，PTC伴侧颈区淋巴结转移患者血浆NONHSAT037832水平降低。但本研究的不足之处为样本量小、随访时间短，进一步研究应扩大样本量、延长随访时间。

[1] Schmitz SU, Grote P, Herrmann BG. Mechanisms of long noncoding RNA function in development and disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2016,73(13):2491-2509.

[2] Yang M, Tian J, Guo X, et al. Long noncoding RNA are aberrantly expressed in human papillary thyroid carcinoma[J]. Oncol Lett, 2016,12(1):544-552.

[3] 王刚平,张红,武杰，等.多灶性甲状腺乳头状癌生物学行为分析[J].山东医药,2011,51(29):72-73.

[4] La Vecchia C, Malvezzi M, Bosetti C, et al. Thyroid cancer mortality and incidence: a global overview[J]. Int J Cancer, 2015,136(9):2187-2195.

[5] 杨雷 ,郑荣寿 ,王宁，等.2010年中国甲状腺癌发病与死亡情况[J].中华预防医学杂志，2014,48(8):663-668.

[6] Pelizzo MR, Merante Boschin I, Toniato A, et al. Diagnosis, treatment, prognostic factors and long-term outcome in papillary thyroid carcinoma[J]. Minerva Endo, 2008,33(4):359-379.

[7] Isaacs JD, McMullen TP, Sidhu SB, et al. Predictive value of the Delphian and level Ⅵ nodes in papillary thyroid cancer[J]. ANZ J Surg, 2010,80(11):834-838.

[8] Lee DW, Ji YB, Sung ES, et al. Roles of ultrasonography and computed tomography in the surgical management of cervical lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma[J]. Eur J Surg Oncol, 2013,39(2):191-196.

[9] Mendez W, Rodgers SE, Lew JI, et al. Role of surgeon-performed ultrasound in predicting malignancy in patients with indeterminate thyroid nodules[J].Ann Surg Oncol, 2008,15(9):2487-2492.

[10] Lee YS, Lim YS, Lee JC, et al. Differential expression levels of plasma-derived miR-146b and miR-155 in papillary thyroid cancer[J].Oral Oncol, 2015,51(1):77-83.

[11] Riedmaier I, Pfaffl MW.Transcriptional biomarkers--high throughput screening, quantitative verification, and bioinformatical validation methods[J].Methods, 2013,59(1):3-9.

[12] Kentwell J, Gundara JS, Sidhu SB. Noncoding RNAs in endocrine malignancy[J]. Oncologist, 2014,19(5):483-491.

[13] Dong L, Qi P, Xu MD, et al. Circulating CUDR, LSINCT-5 and PTENP1 long noncoding RNAs in sera distinguish patients with gastric cancer from healthy controls[J]. Int J Cancer, 2015,137(5):1128-1135.

[14] Tong YS, Wang XW, Zhou XL,et al.Identification of the long non-coding RNA POU3F3 in plasma as a novel biomarker for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Cancer, 2015,143.

[15] Lan X, Sun W, Zhang P, et al. Downregulation of long noncoding RNA NONHSAT037832 in papillary thyroid carcinoma and its clinical significance[J].Tumour Biol, 2016,37(5):6117-6123.

江苏省卫生厅科研基金面上项目(H201203)。

沈美萍(E-mail: 349122679@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.025

R736.1

B

1002-266X(2017)19-0081-03

2017-02-28)