人乳腺癌组织和细胞中TNFR1表达及其对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响

金莲锦，李云矗，李罡，徐春燕，孙平

(1牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江牡丹江157011；2牡丹江医学院；3牡丹江肿瘤医院)

人乳腺癌组织和细胞中TNFR1表达及其对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响

金莲锦1，李云矗2，李罡1，徐春燕3，孙平2

(1牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江牡丹江157011；2牡丹江医学院；3牡丹江肿瘤医院)

目的 观察人乳腺癌组织和细胞中肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的表达，以及抑制人乳腺癌细胞MCF-7中TNFR1表达对细胞增殖及凋亡的影响，并探讨相关机制。方法 取新鲜乳腺癌组织及癌旁组织各30例、人乳腺癌细胞株(MCF-7、MDA-MB-231、T47D)和人正常乳腺细胞，采用Real-time PCR法检测组织和细胞中的TNFR1 mRNA；将MCF-7细胞分为3组，A组不转染，B组转染阴性对照质粒，C组转染siRNA-TNFR1质粒，转染72 h后分别采用MTT法及流式细胞仪观察细胞增殖及凋亡，Western blot法检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8(Caspase-8)及核转录因子κB(NF-κB)。结果 人乳腺癌组织和癌旁组织中TNFR1 mRNA相对表达量分别为1.41±0.08和0.38±0.05，癌组织与癌旁组织相比P<0.05；人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、T47D中TNFR1 mRNA相对表达量分别为2.48±0.06、1.51±0.02、1.66±0.01，人正常乳腺细胞中TNFR1 mRNA相对表达量为1.00±0.09，人乳腺癌细胞与人正常乳腺细胞相比P均<0.05。A、B、C组细胞增殖能力(吸光度值)分别为0.96±0.09、0.93±0.11、0.62±0.05，细胞凋亡率分别为8.23%±3.50%、9.92%±3.19%、24.61%±2.46%，C组与A、B组比较P均<0.05。A、B、C组细胞中Caspase-8蛋白相对表达量分别为0.40±0.03、0.42±0.05、0.82±0.01，NF-κB蛋白表达相对量分别为0.79±0.03、0.76±0.04、0.32±0.06，C组与A、B组比较P均<0.05。结论 人乳腺癌组织和细胞中TNFR基因高表达，其可能通过激活NF-κB信号通路抑制Caspase-8的表达来促进乳腺癌细胞增殖、抑制细胞亡。

乳腺癌；MCF-7细胞;肿瘤坏死因子受体1;半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8；核转录因子κB

据2012年全球范围统计，每年大约有167万女性被确诊为乳腺癌患者，死亡人数接近52万[1]。目前乳腺癌的发病机制仍不清楚，因此研究乳腺癌的发病机制，寻找新的诊断和治疗靶点迫在眉睫。研究表明，癌症的发生和发展与慢性炎症形成的微环境有关。微环境中大量的炎症因子在肿瘤的发生和发展过程中起到重要的调节作用[2～4]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是肿瘤微环境中的重要一员，主要通过与两个TNF-α受体(TNFR1和TNFR2)结合发挥生物学作用，而TNFR1是介导TNF-α发挥生物学功能的主要受体[5～7]。目前，关于乳腺癌TNFR1的表达、作用及相关信号传导通路的研究国内外报道不多。2015年9月～2016年7月，我们采用Real-time PCR检测乳腺癌组织和细胞中TNFR1 mRNA的表达，并利用RNAi技术构建靶向TNFR1的siRNA质粒转染MCF-7细胞，观察抑制TNFR1表达对乳腺癌细胞生长、凋亡的影响及相关分子机制，旨在明确TNFR1在乳腺癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2015年9月～2016年1月牡丹江肿瘤医院切除的新鲜乳腺癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘约5 cm)各30例，置于液氮罐内冷冻保存备用。人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、T47D(上海细胞研究所)。siRNA-TNFR-1质粒(中国万类公司)，TRIzol试剂、LipofectamineTM2000 (美国Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，2×SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒(中国碧云天公司)，DMEM、胎牛血清(中国四季青公司)，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(中国晶美公司)，鼠抗人TNFR-1抗体、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8(Caspase-8)抗体、鼠抗人NF-κB抗体(美国Santa Cruz公司)，PCR引物由上海博亚生物工程公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 乳腺癌组织和细胞中TNFR-1 mRNA检测 采用Real-time PCR法。用TRIzol法提取组织和细胞内的总RNA，RT-PCR逆转录cDNA, SYBR Premix Ex Taq试剂盒用于Real-time PCR定量检测。引物序列：TNFR1上游引物为5′-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3′, 下游引物为5′-CCGTTGGTAGCGATACATTA-3′；内参U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物为5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′。按照试剂盒说明书操作，每个样品重复3次，以2-ΔΔCT法计算TNFR-1 mRNA相对表达量。

1.2.2 MCF-7 细胞分组与质粒转染 将4×105个MCF-7 细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，接种于24孔板，置于5% CO2、37 ℃培养箱过夜。将细胞分为三组，按LipofectamineTM2000说明书进行转染。A组只加LipofectamineTM2000，B组转染阴性对照质粒，C组转染siRNA-TNFR1质粒,每组设6个复孔。siRNA-TNFR1序列：上游引物为5′-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3′，下游引物为5′-CCGTTGGTA GCGATACATTA-3′。转染72 h后，于倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，B、C组质粒转染效率均达95%左右。

1.2.3 MCF-7 细胞增殖能力观察 采用MTT法。将三组MCF-7细胞密度调整为1×104/mL，接种于96孔培养板。转染72 h后,加入MTT标记混合液继续培养4 h,弃上清液。每孔加入DMSO震荡10 min，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(波长490 nm)，以此表示细胞增殖能力。

1.2.4 MCF-7细胞凋亡观察 采用流式细胞仪。收集转染72 h后的三组细胞，均加入Annexin V凋亡试剂，常温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞凋亡率为染有Annexin V的细胞占全部细胞的百分比，实验重复3次。

1.2.5 MCF-7细胞中Caspase-8及NF-κB蛋白检测 采用Western blot法。提取三组细胞的总蛋白，以BCA检测定量，等量总蛋白12%凝胶电泳。电转移于硝酸纤维素膜，先后加入鼠抗人TNFR1抗体(1∶500)、Caspas-8抗体(1∶500)和NF-κB蛋白(1∶500)，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(1∶1 000)二抗，β-actin(1∶4 000)作为内参。ECL化学发光法显影，以目的条带与内参条带光密度比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 人乳腺癌组织和细胞中TNFR1 mRNA表达比较 人乳腺癌组织和癌旁组织中TNFR1 mRNA相对表达量分别为1.41±0.08和0.38±0.05，癌组织与癌旁组织相比P<0.05。人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、T47D中TNFR1 mRNA相对表达量分别为2.48±0.06、1.51±0.02、1.66±0.01，人正常乳腺细胞中TNFR1 mRNA相对表达量为1.00±0.09，人乳腺癌细胞与人正常乳腺细胞相比P均<0.05。

2.2 各组细胞增殖能力比较 A、B、C组细胞增殖能力分别为0.96±0.09、0.93±0.11、0.62±0.05，C组与A、B组比较P均<0.05。

2.3 各组细胞凋亡率比较 A、B、C组细胞凋亡率分别为8.23%±3.50%、9.92%±3.19%、24.61%±2.46%，C组与A、B组比较P均<0.05。

2.4 各组细胞中Caspase-8和NF-κB蛋白表达比较 A、B、C组细胞中Caspase-8蛋白相对表达量分别为0.40±0.03、0.42±0.05、0.82±0.01，NF-κB蛋白表达相对量分别为0.79±0.03、0.76±0.04、0.32±0.06，C组与A、B组比较P均<0.05。

3 讨论

TNFR1作为介导TNF-α生物学效应的主要受体，存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面[8，9]。徐洁等[10]采用Western blot和免疫组化法检测了胆脂瘤上皮组织中TNFR1的表达和分布，发现TNFR1在胆脂瘤上皮组织中呈高表达；闫锡钊等[11]同样证实，TNFR1在基因转录和翻译水平均与宫颈癌癌变呈正相关。Rivas等[12]发现，大鼠乳腺癌细胞C4HD中TNFR1表达上调，选择性抑制TNFR1的表达可明显抑制肿瘤细胞的增殖。但是，关于人乳腺癌组织和细胞中TNFR1的表达研究还未见相关报道。本研究采用Real-time PCR检测TNFR1基因在乳腺癌组织和细胞株中的表达，结果TNFR1 基因表达明显升高，表明TNFR1在乳腺癌细胞发生发展过程中起着重要作用。

RNAi是由双链RNA引发的、序列特异的同源基因转录后基因沉默现象，是一种高效、特异地抑制基因表达进而研究基因功能的常用技术[13，14]。为明确TNFR1对乳腺癌细胞生物学行为的影响，我们构建了靶向TNFR1的siRNA质粒，通过脂质体转染MCF-7细胞，然后逆向特定地观察抑制TNFR1表达对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响。本研究结果显示，siRNA-TNFR1质粒能明显抑制MCF-7细胞增殖，促进MCF-7细胞凋亡，提示TNFR1可能在乳腺癌细胞增殖加快、凋亡抑制中起作用。但是，TNFR1如何促进乳腺癌细胞增殖以及相关的调控机制尚不十分清楚。

研究表明，TNFR1通过内化形成死亡信号复合体可激活下游的Caspase-8级联反应，导致细胞凋亡，发挥抗肿瘤和抗炎效应[15]；同时，TNFR1也可以激活NF-κB介导细胞增殖及炎性反应，具有抗凋亡效果[16]。Wen等[17]研究一种永生化的小胶质细胞瘤时发现，该肿瘤细胞内TNFR1 mRNA和蛋白的表达上调可导致细胞死亡。而Diegmann等[18]研究人乳头状肾细胞癌时发现，TNFR1可通过激活NF-κB信号通路促进肿瘤细胞的增殖。可见，TNFR1介导的肿瘤细胞生物学行为具有双重作用，这种双重作用的发挥取决于激活不同的信号传导通路在细胞内作用的强弱对比。为了探究乳腺癌内TNFR1抗凋亡的机制，我们采用Western blot法检测了siRNA-TNFR1质粒转染的MCF-7细胞Caspase-8和NF-κB蛋白的表达。结果发现，抑制MCF-7细胞TNFR1表达后，细胞内Caspase-8蛋白表达水平明显升高，而NF-κB蛋白表达水平明显下降。这提示乳腺癌细胞MCF-7中高表达的TNFR1很有可能通过激活NF-κB信号通路，抑制Caspase-8的活化发挥抗凋亡的作用。我们推测，在MCF-7细胞中TNFR1的功能以诱导细胞凋亡为主，但这种作用被高度活化的NF-κB信号通路所抑制，因此细胞呈现增殖加速、凋亡减少的生物学行为。但是，在这一过程中TNFR1激活的Caspase-8 和NF-κB信号传导通路是如何相互作用的还有待进一步研究。

总之，本研究有助于进一步认识TNFR1在乳腺癌发生发展中发挥的作用，为深入研究TNFR1介导的肿瘤生物学多效性机制提供了依据，从而为乳腺癌治疗提供新的思路和靶点。

[1] Ferlay J, Soeriomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer, 2015,136(5):E359-386.

[2] Rasch S, Algül H. A clinical perspective on the role of chronic inflammation in gastrointestinal cancer[J]. Clin Exp Gastroenterol, 2014,7:261-272.

[3] Francescone R, Hou V, Grivennikov SI. Microbiome, inflammation, and cancer[J]. Cancer J, 2014,20(3):181-189.

[4] Bower JE, Lamkin DM. Inflammation and cancer-related fatigue: Mechanisms, contributing factors, and treatment implications[J]. Brain Behav Immun, 2013,30(Suppl):48-57.

[5] Zhu G, Du Q, Wang X, et al. TNF-α promotes gallbladder cancer cell growth and invasion through autocrine mechanisms[J]. Int J Mol Med, 2014,33(6):1431-1440.

[6] Tomita Y, Yang X, Ishida Y, et al. Spontaneous regression of lung metastasis in the absence of tumor necrosis factor receptor p55[J]. Int J Cancer, 2004,112(6):927-933.

[7] Charles KA, Kulbe H, Soper R, et al. The tumor-promoting actions of TNF-α involve TNFR1 and IL-17 in ovarian cancer in mice and humans[J]. J Clin Invest, 2009,119(10):3011-3023.

[8] Oshima H, Ishikawa T, Yoshida GJ, et al. TNF-α/TNFR1 signaling promotes gastric tumorigenesis through induction of Noxo1 and Gna14 in tumor cells[J]. Oncogene, 2014,33(29):3820-3829.

[9] Choi SW, Stiff P, Cooke K, et al. TNF-inhibition with etanercept for graft-host diseases prevention in highrisk HCT: lower TNFR1 levels correlate with better outcomes[J]. Biol Blood Marrow Transplant, 2012,18(10):1525-1532.

[10] 徐洁,李朝军,夏琛,等.肿瘤坏死因子受体1在中耳胆脂瘤上皮中的表达[J].中华耳科学杂志,2007, 5(1): 94-97.

[11] 闫锡钊,马冬,张丽杰,等.TNF-α和TNFR1在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义[J].肿瘤防治研究,2016,43(6)：497-501.

[12] Rivas MA, Carnevale RP, Proietti CJ, et al. TNF-α acting on TNFR1 promotes breast cancer growth via p42/p44 MAPK, JNK, Akt and NF-κB-dependent pathways[J]. Exp Cell Res, 2008,314(3):509-529.

[13] Kim HJ, Kim A, Mivata K, et al. Recent progress in development of siRNA delivery vehicles for cancer therapy[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016,104:61-77.

[14] Aigner A, Fischer D. Nanoparticle-mediated delivery of small RNA molecules in tumor therapy[J]. Pharmazie, 2016,71(1):27-34.

[15] Badiola N, Malagelada C, Llecha N, et al. Activation of caspase-8 by tumour necrosis factor receptor 1 is necessary for caspase-3 activation and apoptosis in oxygen-glucose deprived cultured cortical cells[J]. Neurobiol Dis, 2009,5(3):438-447.

[16] Wertz IE. TNFR1-activated NF-κB signal transduction: regulation by the ubiquitin/proteasome system[J]. Curr Opin Chem Biol, 2014,23:71-77.

[17] Wen W, Sanelli T, Ge W, et al. Activated microglial supernatant induced motorueron cytotoxicity is associated with upregulation of the TNFR1 receptor[J]. Neurosci Res, 2006,55(1):87-95.

[18] Diegmann J, Tomiuk S, Sanjmyatav J, et al. Comparative transcriptional and functional profiling of clear cell and papillary renal cell carcinoma[J]. Int J Mol Med, 2006,18(3):395-403.

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医药学名词常见错误及正确写法

药品名称：错误(正确)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，维甲酸(维A酸)，双磷酸盐(双膦酸盐)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博莱霉素(博来霉素)，开浦兰(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(异丙嗪)，四乙铵(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大环内脂类(大环内酯类)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，头胞哌酮(头孢哌酮)。

疾病及其相关名称：错误(正确)

甲状腺机能(甲状腺功能)，血沉(红细胞沉降率)，X光片(X线片)，帕金森症(帕金森病)，食道(食管)，适应征、适应症(适应证)，禁忌征、禁忌症(禁忌证)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，脑梗塞(脑梗死)，毒副反应(不良反应)，肌肉注射(肌内注射)，心率失常(心律失常)，中风(卒中)，生理机能(生理功能)，返流(反流)，血液动力学(血流动力学)，机能(功能)，人流(人工流产)，药动学(药代动力学)，绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)，机理(机制)，围产期(围生期)，氧和指数(氧合指数)，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管紧张素转换酶(血管紧张素转化酶)，血管紧张肽转换酶抑制剂(血管紧张素转化酶抑制剂)，咳血(咯血)，心房纤颤(心房颤动)，脑溢血(脑出血)，稳定性心绞痛(稳定型心绞痛)，法乐四联症(法洛四联症)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，视网膜神经胶质瘤(视网膜母细胞瘤)，剖腹产术(剖宫产术)。

其他：错误(正确)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滞(黏滞)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘质沙雷菌(黏质沙雷菌)，层黏联蛋白(层黏连蛋白)，机率、几率(概率)，脱腊(脱蜡)，侧枝循环(侧支循环)，纵膈(纵隔)，红血球(红细胞)，白血球(白细胞)。

Expression of TNFR1 in human breast cancer tissue and cells and its effecton proliferation and apoptosis of MCF-7 cells

JINLianjin1,LIYunchun,LIGang,XUChunyan,SUNPing

(1TheAffiliatedHongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniverstiy,Mudanjiang157011,China)

Objective To observe the expression of tumor necrosis factor receptor-1 (TNFR1) in the human breast cancer tissues and cells and the effect of inhibiting TNFR1 expression on the proliferation and apoptosis of MCF-7 cells, and to discuss the mechanism. Methods The TNFR1 mRNA expression was detected in 30 cases of human breast cancer tissues and adjacent tissues, and cells (MCF-7, MDA-MB-231 and T47D) by real-time PCR. MCF-7 cells were divided into 3 groups: groups A, B and C. Group A (control group) was not transfected, group B was transfected with negative vector and group C was transfected with siRNA-TNFR1 vector. After transfection for 72 h, MTT and flow cytometry were used to detect proliferation and apoptosis of MCF-7 cells, respectively; and Western blot was performed to determine the Caspase-8 and nuclear factor-κB (NF-κB). Results The relative expression of TNFR1 in the human breast cancer tissues and adjacent tissues was 1.41±0.08 and 0.38±0.05, respectively. The relative expression of TNFR1 in MCF-7, MDA-MB-231, T47D and normal breast cells was 2.48±0.06, 1.51±0.02, 1.66±0.01 and 1.00±0.09, respectively. TNFR1 expression in the breast cancer tissues and cells was higher than that of the control group (P<0.05). The optimal density in proliferation of groups A, B and C was 0.96±0.09, 0.93±0.11 and 0.62±0.05, respectively. The apoptosis rates of groups A, B and C were 8.23%±3.50%, 9.92%±3.19% and 24.61%±2.46%, respectively. Significant difference was found in the proliferation and apoptosis rate between groups A, B and C (allP<0.05). The Caspase-8 expression in the groups A, B and C was 0.40±0.03, 0.42±0.05, 0.82±0.01, and the NF-κB protein expression was 0.79±0.03, 0.76±0.04 and 0.32±0.06, respectively. Significant difference was found between groups A, B and C (allP<0.05).Conclusion TNFR1 is highly expressed in human breast cancer tissues and cells and probably promotes the cell proliferation and suppresses the apoptosis by activating NF-κB signaling pathway and inhibiting Caspase-8 expression.

breast carcinoma; MCF-7 cells; tumor necrosis factor receptor-1; Caspase-8; nuclear factor-κB

黑龙江省自然科学基金项目(H201377)；黑龙江省卫生厅科研课题(2012-285)。

金莲锦(1977-)，女，副教授，主要研究方向为肿瘤与炎症的关系。E-mail: jinlianjin0410@163.com

孙平(1973-)，女，副教授，主要研究方向为肿瘤与炎症的关系。E-mail: spmy73@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.004

R730.21

A

1002-266X(2017)18-0012-04

2016-12-15)