外泌体在儿童支气管哮喘发病及诊治中的作用研究进展

刘超，汪俊

(1南昌大学研究生院医学部，南昌 330006;2江西省人民医院)

外泌体在儿童支气管哮喘发病及诊治中的作用研究进展

刘超1,2，汪俊2

(1南昌大学研究生院医学部，南昌330006;2江西省人民医院)

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，患者多同时伴有可变的气流受限和气道高反应性。外泌体是一种能被多种细胞所分泌的囊泡小体，包含蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等生物活性物质，参与介导免疫应答、抗原呈递、炎症反应和细胞迁移等多种病理生理过程。近年来有研究表明外泌体可参与支气管哮喘患者的炎症反应过程和细胞间通讯，在支气管哮喘发病过程中发挥作用。外泌体可能是诊断支气管哮喘的标志物及治疗支气管哮喘的靶点。

支气管哮喘；外泌体；白三烯；微小RNA

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种炎症细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。目前全球患病人数接近3亿，且患病率仍呈现不断上升的趋势，预计到2025年患病人数将达到4亿[1]。目前临床上治疗哮喘主要依靠吸入支气管扩张剂和激素，但对于中重度哮喘以及激素抵抗性哮喘治疗效果欠佳。外泌体是一种纳米级的囊泡小体，由多种细胞分泌，存在于支气管肺泡灌洗液(BALF)、血液、乳汁、尿液及唾液等体液中。近年研究发现，外泌体参与哮喘的炎症反应，诱导炎症细胞的迁移，其中的miRNA参与细胞间通讯。外泌体在哮喘的发生、发展过程中可能具有重要的作用，也是有前景的支气管哮喘诊断标志物及治疗靶点。现综述如下。

1 外泌体的结构、来源及功能

1987年Johnstone等[2]首次从绵羊网织红细胞的培养中发现了这种囊泡，并将其命名为外泌体。外泌体是直径40～100 nm的微小囊泡，具有典型的脂质双层膜结构，脂质外膜含有神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂和神经节苷脂GM3等多种成分，能有效的保护其内容物免受酶的降解[3]。外泌体中的蛋白质可分为两种类型：一类是在不同细胞来源的外泌体上均有表达，如四次跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81等)、膜转运及融合蛋白、Tsg101、Alix等；另一类则是特异性蛋白，如与抗原呈递相关的主要组织相容性复合体-Ⅰ(MHC-Ⅰ)和主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ)等[4]。外泌体携带的核酸主要有mRNA、miRNA等多种遗传物质，可参与细胞间遗传信息的传递。外泌体可以被多种细胞类型所分泌，如B细胞、人树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、T细胞、上皮细胞及肿瘤细胞等[5]。外泌体也广泛存在于BALF[5]、血液、乳汁、尿液及唾液[6～9]等体液中。

外泌体在胞内体系统中形成。胞内体系统由内吞囊泡、早期胞内体、晚期胞内体和溶酶体构成；内吞囊泡由网格蛋白或非网格蛋白介导，将各种类型的分子运输到早期胞内体，早期胞内体与其他膜或囊泡融合后形成晚期胞内体[10]，晚期胞内体将其排出到细胞外的腔中形成腔内囊泡，这些晚期胞内体也被称为多泡体(MVB)。MVB 的形成过程是由ESCRT复合物(ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ四种可溶性多蛋白复合物组成)所介导的。最初只是认为MVB和溶酶体融合后以降解相关蛋白质或脂质，随后才进一步发现MVB能与质膜融合后释放囊泡到胞外，而这些只有纳米大小的囊泡就是外泌体[11]。

外泌体在细胞间通讯中发挥重要的作用，它可以穿过质膜将其内容物卸载，进而影响受体细胞的表型及功能[12]。不同细胞来源的外泌体，其功能也就不同。例如，Raposo等[13]发现B淋巴细胞中可以分离外泌体，并证明外泌体在体内表现为抗原呈递作用，诱导T细胞的反应，参与免疫细胞的调节。Thery等[14]发现衍生自抗原呈递细胞的外泌体能在细胞表面表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子，有助于激活CD4+T细胞和CD8+T细胞以诱导特异性免疫应答。Lasser等[15]还发现外泌体能从鼻腔灌洗液中分离，通过细胞迁移测定分析，证明鼻腔中外泌体可以诱导单核细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞的迁移，因此鼻腔灌洗液的外泌体可以诱导先天性免疫细胞的迁移。

2 外泌体在哮喘发病中的作用

2.1 参与炎症反应 与哮喘有关的外泌体产物，主要是巨噬细胞、树突状细胞(DC)[16]、上皮细胞[17]及嗜酸性粒细胞[18]产生，存在于BALF[5]和鼻腔灌洗液(NLF)[19]中。白细胞三烯(LTs)是来源于花生四烯酸AA)的促炎介质，在慢性炎症的发病机制中起关键性的作用。LTA4是AA通过胞质磷酸酶A2从核膜释放和5-脂氧合酶氧化所形成的中间体，通过LTA4水解酶可以生成LTB4，LTA4通过LTC4合酶形成LTC4[20]。转化因子-β1(TGF-β1)可以参与过敏性炎症和促进气道的重塑[21]。Esser等[22]发现来源于巨噬细胞和DC的外泌体具有LT生物合成的功能性酶，也证明了LTC4合酶及LTA4水解酶存在于外泌体中。TGF-β1趋向于下调巨噬细胞的CD14、HLA-DR、CD63、ICAM-1等蛋白的水平，说明TGF-β1能降低巨噬细胞中外泌体的蛋白水平；在 Ca2+和AA的刺激下，外泌体产生趋化性类花生酸来诱导粒细胞的迁移，通过增强粒细胞的迁移可以加重哮喘的炎症反应[22]。Paredes等[23]也发现了类似的结果，轻度桦树花粉过敏性哮喘患者BALF外泌体CD63、CD81、CD36、HLA-DR蛋白水平明显高于正常对照组，其在哮喘患者中表现出不同的表型及功能；进一步发现来自哮喘的BALF外泌体可增加支气管上皮细胞中LT的形成和IL-8的释放，而半胱氨酰白三烯受体拮抗剂孟鲁司特能降低外泌体诱导的IL-8释放，因此BALF外泌体也具有LT生物合成能力，参与哮喘的炎症反应。

Kulshreshtha等[24]研究发现支气管上皮细胞(BEC)是哮喘患者肺中外泌体的主要来源，哮喘小鼠BEC分泌的外泌体及其相关蛋白(CD63、Rab-27b、Tsg-101和Alix)高于正常小鼠；在IL-13的影响下，BEC分泌的外泌体可以诱导单核细胞(未分化的巨噬细胞)的增殖和趋化来加重炎症反应。Canas等[25]发现嗜酸性粒细胞通过增加外泌体的释放参与哮喘的炎症反应，同时外泌体能诱导嗜酸性粒细胞中NO及ROS产量增加，加重炎症反应；研究也进一步证实外泌体可以诱导嗜酸性粒细胞的迁移及黏附，并引起黏附分子如ICAM-1和integrin α2的特异性表达增强，因此外泌体在嗜酸性粒细胞中发挥的主要效应是作为趋化因子。

2.2 参与细胞间通讯 外泌体是微小的囊泡，通过胞吞作用，携带miRNA进入受体细胞与之结合从而介导细胞间的通讯。循坏外泌体miRNA在体液或细胞中是相对稳定的，外泌体可以保护miRNA免于RNA酶的降解。Pegtel等[26]证明被感染的B细胞分泌外泌体中存在成熟EBV编码的miRNA；通过外泌体转移的外源EBV-miRNA被递送到受体细胞中，导致受体细胞中miRNA靶向基因的抑制。Valadi等[27]发现来源于人和小鼠的肥大细胞中存在外泌体RNA，而且来源小鼠肥大细胞的外泌体可以将RNA转移到另一个小鼠的肥大细胞中，继而在受体细胞中发现新的蛋白，表明转移的RNA能从一个细胞转移到另一个细胞中进行翻译，说明转移的RNA是有功能的。

Levanen等[28]首次发现轻度间歇性哮喘患者与健康者BALF外泌体中24种miRNA表达存在差异，包括let-7家族成员及miRNA-200家族成员，大多数miRNA下调。

3 外泌体在哮喘诊断及治疗中的应用效果

外泌体内蛋白miRNA表达比细胞内稳定性更高，因此可用于疾病的早期诊断[12]。外泌体已被作为肿瘤早期诊断的标志物。有学者发现血液中has-miR-21的上调是肺癌早期诊断的生物标志物。乳腺癌细胞株MDA-MB-231外泌体中miR-105水平明显高于正常乳腺上皮细胞，因此外泌体中miR-105可作为早期诊断乳腺癌的生物标志物[31]。

Mazzeo等[18]发现哮喘患者嗜酸性粒细胞外泌体的释放量高于正常对照组，并且在IFN-γ刺激后，外泌体相关蛋白表达量升高，这说明外泌体很参与了哮喘的发病过程，而嗜酸性粒细胞外泌体中相关蛋白很可能是哮喘诊断的生物标志物。有学者发现哮喘患者呼出气冷凝液外泌体中11种miRNA表达高于健康人，其中has-miR-574-5p、has-miR-516a-5p、has-miR-421涉及哮喘相关通路。另有学者研究发现与对照组相比，OVA喂养的小鼠血清中的耐受性外泌体可以显著降低嗜酸性粒细胞浸润及血清IgE的水平，可抑制TH1和Th2主导的免疫应答，证明外泌体能诱导免疫耐受，因此外泌体可能为过敏性反应的治疗提供潜在的治疗靶点。有学者发现抗原耐受性小鼠鼻内给予外泌体可以防治过敏性反应，其通过抑制IgE应答、Th2细胞因子的产生及气道炎症来实现，还提出以外泌体为载体的抗过敏疫苗可应用于过敏性疾病的治疗。另一项研究却表明，外泌体抑制剂GW4869的使用明显降低了BALF中浸润细胞的数目、血清IgE及炎症因子(IL-13、IL-4、IL-5)的水平，而哮喘的气道高反应性及气道炎症也相应的缓解[24]。

综上所述，外泌体在哮喘的发生和发展过程中具有重要的作用，但外泌体具体通过哪些信号通路的转导而在哮喘中发挥生物学效应尚不明确。呼出气体冷凝液中外泌体miRNA具有成为哮喘早期诊断的生物标志物的可能，但其诊断效果还需要研究证明。外泌体可能作为一种新型的靶向药物或者疫苗应用于哮喘的治疗，但目前只是一种推测，暂未应用临床工作中。

[1] Prado N, Marazuela EG, Segura E, et al. Exosomes from bronchoalveolar fluid of tolerized mice prevent allergic reaction[J]. J Immunol, 2008,181(2):1519-1525.

[2] Johnstone RM, Adam M, Hammond JR, et al. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J]. J Biol Chem, 1987,262(19):9412-9420.

[3] Ventimiglia LN, Alonso MA. Biogenesis and Function of T Cell-Derived Exosomes[J]. Front Cell Dev Biol, 2016,4(455):84.

[4] Yu S, Cao H, Shen B，et al. Tumor-derived exosomes in cancer progression and treatment failure[J]. Oncotarget, 2015,6(35):37151-37168.

[5] Qazi KR, Torregrosa PP, Dahlberg B, et al. Proinflammatory exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of patients with sarcoidosis[J]. Thorax, 2010,65(11):1016-1024.

[6] Caby MP, Lankar D, Vincendeau-Scherrer C, et al. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma[J]. Int Immunol, 2005,17(7):879-887.

[7] Admyre C, Johansson SM, Qazi KR, et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk[J]. J Immunol, 2007,179(3):1969-1978.

[8] Prunotto M, Farina A, Lane L, et al. Proteomic analysis of podocyte exosome-enriched fraction from normal human urine[J]. J Proteomics, 2013,8(28):193-229.

[9] Ogawa Y, Miura Y, Harazono A, et al. Proteomic analysis of two types of exosomes in human whole saliva[J]. Biol Pharm Bull, 2011,34(1):13-23.

[10] Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, et al. Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function[J]. Immunol Lett, 2006,107(2):102-108.

[11] Anna-Kristin Ludwig, Bernd Giebel. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012,44(1):11-15.

[12] Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1820(7):940-948.

[13] Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles[J]. J Exp Med, 1996,183(3):1161-1172.

[14] Thery C, Duban L, Segura E, et al. Indirect activation of naive CD4+T cells by dendritic cell-derived exosomes[J]. Nat Immunol, 2002,3(12):1156-1162.

[15] Lasser C, O′Neil SE, Shelke GV, et al. Exosomes in the nose induce immune cell trafficking and harbour an altered protein cargo in chronic airway inflammation[J]. J Transl Med, 2016,14(1):181.

[16] Esser J, Gehrmann U, D′Alexandri FL, et al. Exosomes from human macrophages and dendritic cells contain enzymes for leukotriene biosynthesis and promote granulocyte migration[J]. J Allergy Clin Immunol, 2010,126(5):1032-1040.

[17] Kulshreshtha A, Ahmad T, Agrawal A, et al. Proinflammatory role of epithelial cell-derived exosomes in allergic airway inflammation[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013,131(4):1194-1203.

[18] Mazzeo C, Canas JA, Zafra MP, et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2015,135(6):1603-1613.

[19] Lasser C, O′Neil SE, Ekerljung L, et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions[J]. Am J Rhinol Allergy, 2011,25(2):89-93.

[20] Peters-Golden M, Henderson WR Jr. Leukotrienes[J]. N Engl J Med, 2007，357(18):1841-1854.

[21] Altraja S, Jaama J, Altraja A. Proteome changes of human bronchial epithelial cells in response to pro-inflammatory mediator leukotriene E4 and pro-remodelling factor TGF-beta1[J]. J Proteomics, 2010,73(6):1230-1240.

[22] Esser J, Gehrmann U, D′Alexandri FL, et al. Exosomes from human macrophages and dendritic cells contain enzymes for leukotriene biosynthesis and promote granulocyte migration[J]. J Allergy Clin Immunol, 2010,126(5):1032-1040.

[23] Torregrosa Paredes P, Esser J, Admyre C, et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma[J]. Allergy, 2012,67(7):911-919.

[24] Kulshreshtha A, Ahmad T, Agrawal A, et al. Proinflammatory role of epithelial cell-derived exosomes in allergic airway inflammation[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013,131(4):1194-1203.

[25] Canas JA, Sastre B, Mazzeo C, et al. Exosomes from eosinophils autoregulate and promote eosinophil functions[J]. J Leukoc Biol, 2017,101(5):1191-1199.

[26] Pegtel DM, Cosmopoulos K, Thorley-Lawson DA, et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(14):6328-6333.

[27] Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J]. Nat Cell Biol, 2007,9(6):654-659.

[28] Levanen B, Bhakta NR, Torregrosa Paredes P, et al. Altered microRNA profiles in bronchoalveolar lavage fluid exosomes in asthmatic patients[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013,131(3):894-903.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.033

A

1002-266X(2017)35-0099-03

2017-06-23)

汪俊(E-mial：wangjun5087@163.com)