广东地区人群MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性与非综合征性唇腭裂发病的关系

兰菲菲，丁红珂，陈延冰，杜丽，尹爱华

(广东省妇幼保健院，广州 511442)

广东地区人群MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性与非综合征性唇腭裂发病的关系

兰菲菲，丁红珂，陈延冰，杜丽，尹爱华

(广东省妇幼保健院，广州511442)

目的探讨MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性与广东人群非综合征性唇腭裂(NSCL/P)发病的相关性。方法收集162例广东地区NSCL/P患者为病例组，178例广东地区健康对照者为对照组，用TaqMan探针和实时荧光定量PCR法检测两组受检者MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性，并比较两组等位基因和基因型分布。结果病例组和对照组的基因型、等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。病例组等位基因T频数169(52.16%)、等位基因C频数155(47.84%)，对照组分别为227(63.76%)、129(36.24%)。两组等位基因频率比较，P<0.05。病例组基因型TT者50例(30.86%)、TC者69例(42.59%)、CC者43例(26.54%)，对照组分别为71例(39.89%)、85例(47.75%)、22例(12.36%)，两组基因型分布相比P<0.05。结论MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性与广东地区NSCL/P发病相关。

非综合征性唇腭裂； MAFB基因；rs13041247位点；单核苷酸多态性；广东省

非综合征性唇腭裂(NSCL/P)，是指不伴发其它系统器官畸形的单纯性唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的总称，是新生儿常见的先天性颌面部畸形之一。其群体发病率约1‰～2‰ ,不同国家发病率相差较大。国外发病率约为0.6‰～1.69‰。我国是NSCL/P的高发国家，发病率约为1.82‰[1]，占出生缺陷的14.01%[2]，仅次于神经管畸形的发生率，在出生严重畸形的发生中占第二位。广东省的唇腭裂发病率约为1.26‰[3]，居各种缺陷的首位或仅次于胎儿水肿综合征。NSCL/P病因尚不明确，是一种复杂的多因素疾病，涉及遗传、环境及两者的相互作用，有一定的种族和地区差异，男女比例大约为2∶1[4]，其病因学研究是目前出生缺陷研究中的焦点问题之一。NSCL/P是多基因遗传病，由遗传和环境因素相互作用引起[5]，遗传学因素在唇腭裂的发病中起重要的作用。有关NSCL/P易感基因的筛选、定位和研究方法是研究的热点和难点。近年来，全基因组关联分析(GWAS)方法发现了一些新的NSCL/P易感基因[6～10]，MAFB基因是其中之一[11]。但是MAFB基因如何在NSCL/P发病过程中发挥作用尚不清楚。本研究观察了广东地区NSCL/P患者MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性变化，探讨MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性与广东地区NSCL/P的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1月～2015年12月广东省妇幼保健院收治的162例NSCL/P患者为病例组，患者出生地均为广东，其中男82例、女80例，年龄1～20岁，明确排除综合征性唇腭裂(SCL/P)。另选同期查体的178例健康人为对照组，其中男90例、女88例，年龄1～20岁。两组受检者性别、年龄相比P均>0.05。本研究已获我院医学伦理委员会批准，两组受检者或其监护人均已签署知情同意书并填写调查问卷。

1.2 MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性检测方法 采集两组受检者EDTA-K2抗凝静脉外周血2 mL，用Lab-Aid核酸DNA分离试剂盒和Lab-Aid820自动核酸提取仪(厦门致善生物科技有限公司)提取基因组DNA。用NanoDrop2000 分光光度计(Thermo Scientific 公司)检测DNA的浓度与纯度后，存放于-80 ℃生物样品库保存。

用TaqMan 单核苷酸多态性检测技术进行等位基因检测和基因型分型。MAFB基因rs13041247位点的TaqMan探针由上海生工生物公司合成，探针上游序列5′-TCCTGGCTGCGTCACTTA-3′，下游序列5′-TCCTGGCTGTGTCACTTA-3′。PCR扩增引物上游序列5′-CCTGGGTTTGTATTCTTC-3′，下游序列5′-GCTCTATCCCAATGTATGT-3′。用96孔板进行PCR扩增反应，反应总体积20 μL，包含Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 μL、上下游引物各0.4 μL、TaqMan探针各0.8 μL、Rox reference Dye 0.4 μL、DNA 模板1 μL、去离子水6.2 μL。用7500 Fast Real-Time PCR system(美国ABI公司)行实时荧光定量PCR，扩增条件为：60 ℃ 1 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20s，65 ℃ 50 s，共40个循环；60 ℃ 1 min。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。先对两组基因型和等位基因分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，如果两组基因型和等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡则采用χ2检验比较两组两组基因型和等位基因分布的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

经过Hardy-Weinberg 平衡检验，病例组和对照组的基因型、等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。病例组等位基因T频数169(52.16%)、等位基因C频数155(47.84%)，对照组分别为227(63.76%)、129(36.24%)。两组等位基因频率比较，P<0.05。病例组基因型TT者50例(30.86%)、TC者69例(42.59%)、CC者43例(26.54%)，对照组分别为71例(39.89%)、85例(47.75%)、22例(12.36%)，两组基因型分布相比P<0.05。

3 讨论

唇腭裂是人类最常见的面部先天性畸形，分为综合征性唇腭裂(SCL/P)和NSCL/P，发病率高。NSCL/P的发病机制比较复杂，至今仍未完全明确[12]。唇腭裂不仅严重影响面部美观，还因为口与鼻腔相通影响患者发育，常导致上呼吸道感染，并发中耳炎，患者吮奶困难，严重的唇腭裂患者不能正常哺乳，导致明显营养不良。唇腭裂患者在生长发育期间说话时吐字不清，影响语言发育，给儿童和家长的心理造成严重的创伤。又因其治疗程序复杂、周期漫长、花费大，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响出生人口素质。因此，唇腭裂的病因和预防的研究非常重要。

MAFB基因位于20q12，编码亮氨酸拉链转录因子[13，14]。动物实验研究发现MAFB基因可能参与鼠的颅面外胚层发育。研究发现MAFB基因在胚胎小鼠颚板的上皮细胞表达较高，推测MAFB基因可能参与了鼠的颚板发育，所以其单核苷酸多态性可能与NSCL /P有关。有学者在2011年报道的研究中发现，华南汉族人群中MAFB基因SNP位点rs6072081、rs17820943 和rs6102085，以及IRF6基因的单核苷酸多态性位点rs10863790与NSCL/P的发病有显著关联。Yuan等[15]在拉丁美洲人群的GWAS 研究中发现MAFB基因的rs11696257和rs13041247位点与NSCL/P相关。rs13041247位点在MAFB基因的下游区，其错义突变可能影响了蛋白结构功能[11]。2015年Sun等[16]通过GWAS方法研究发现MAFB基因的rs13041247位点与NSCL/P相关。以上研究结果均表明MAFB基因是NSCL/P的易感基因[15]，MAFB基因的单核苷酸多态性位点与NSCL/P发病存在很强的相关性。本研究选取的病例组和对照组均为广东地区人群，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，研究群体具有代表性。对病例组与对照组MAFB基因rs13041247位点等位基因和基因型分布进行比较发现，两组MAFB基因rs13041247位点等位基因和基因型分布差异有统计学意义，与Moreno等[12]和Sun等[16]的研究结果相符，进一步证实了MAFB基因rs13041247位点单核苷酸多态性与广东地区NSCL /P发病相关。本研究仅选择了已报道的、通过GWAS分析的有意义的单核苷酸多态位点。如果将来条件允许，可以进一步扩大样本量，或将MAFB基因相关多个单核苷酸多态位点与环境因素纳入进行连锁分析，同时进行家系分析研究，可以更好地探究MAFB基因SNP位点在NSCL/P发病机制中所起的作用。

[1] 肖坤则,张芝燕,李金春，等.中国唇腭裂的流行病学[J].中华医学杂志,1989,69(4):192.

[2] Hofstee Y, Kors N, Hennekam RC. Genetic survey of a group of children with clefting: implications for genetic counseling [J]. Cleft Palat Craniofac J, 1993,30(5):447-451.

[3] 邓煜,连志浩.唇腭裂流行病学研究[J].中华口腔杂志,1991,26(6) :386.

[4] 黄洪章.唇腭裂病因学研究的新进展[J].口腔颌面外科杂志,2007,17(3):201-204.

[5] Michael JD, Mary LM, Terri HB, et al. Cleft lip and palate: synthesizing genetic and environmental influences[J]. Nat Rev Genet, 2011,12(3):167-178.

[6] Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, et al. Interferon regulatory factor 6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate[J]. N Eng J Med, 2004,351(8):769-780.

[7] Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, et al. Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24[J]. Nat Genet, 2009,41(4):473-477.

[8] Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, et al. Genome-wide association study identifies two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate[J]. Nat Genet, 2010,42(1):24-26.

[9] Alkuraya FS, Saadi I, Lund JJ, et al. SUMO1 haplo insufficiency leads to cleft lip and palate[J]. Science, 2006,313(5794):1751.

[10] Mangold E, Ludwig KU, Nothen MM. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting[J]. Trends Mol Med, 2011,17(12):725-733.

[11] Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4[J]. Nat Genet, 2010,42(6):525-529.

[12] Moreno LM, Arcos-Burgos M, Marazita ML, et al. Genetic analysis of candidate loci in non-syndromdic cleft lip families from Antioquia-Colombia and Ohio [J]. Am J Med Genet, 2004,125(2):135-144.

[13] Gemelli C, Montanari M, Tenedini E, et al. Virally mediated MafB transduction induces the monocyte commitment of human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Cell Death Differ, 2006, 13(19):1686-1696.

[14] Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, et al. Identi?cation of primary MAFB target genes in multiplemyeloma[J]. Exp Hematol, 2009,37(2):78-86.

[15] Yuan Q, Blanton SH, Hecht JT. Association of ABCA4 and MAFB with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate[J]. Am J Med Genet A, 2011,155(6):1469-1471.

[16] Sun Y, Huang Y, Yin A, et al. Genome-wide association study identifies a new susceptibility locus for cleft lip with or without a cleft palate[J]. Nat Commun, 2015,6(4):6414.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.018

R722.11

B

1002-266X(2017)35-0055-03

2017-05-18)

广东省医学科研基金项目(B2014021)。

尹爱华(Email: yinaiwa@vip.126.com)