利用无菌柞蚕蛹培育蛹虫草的研究

孙永健 王 华 郭 森 黄登禹 张 博 荣志靖

（1 天津天狮学院生物与食品工程学院，天津301700；2 天津市食品研究所有限公司，天津301609）

蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]又名北冬虫夏草，是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫蛹上形成的子座与蛹的复合体，在我国主要分布于辽宁、内蒙古、吉林等地[1～3]。蛹虫草富含虫草素、虫草酸、虫草多糖等多种生物活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老等功效，药理作用广泛，药用价值较高[4～6]。目前，利用昆虫蛹或幼虫培育蛹虫草的方法主要有两种，一种是通过喂食、喷洒、或与蛹虫草菌丝体共培养的自然感染法，该方法操作简便，但成功率低且耗时较长；另外一种是通过注射、穿刺等方法，人为提高蛹虫草菌感染蛹体效率的人工感染法，相较于自然感染法来说，人为干预可以较大地提高感染的成功率且在一定程度上缩短栽培时间，但由于蛹体或虫体有开放性损伤，容易导致坏蛹率较高，僵化率较低[7～12]。研究采用高温高压的方法对柞蚕蛹[An⁃theraea pernyi Pupa]进行了彻底灭菌，并利用其进行蛹虫草的培育，所获得的产品，较传统方法具有生长速度快、产量高、品质优等特点。新方法的应用，可以为蛹虫草的人工培育开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器新洁尔灭、升汞为北京华威锐科化工有限公司生产；虫草素标准品为Sigma 公司生产；甲醇为色谱纯，购自上海泰瑞尔化学有限公司；磷酸二氢钾、硫酸镁等化学试剂均为分析纯，购自武汉易泰科技有限公司；新鲜滞育柞蚕蛹为市场采购，蛹虫草菌种为天津市工业微生物研究所提供。

GZX-150BS 型光照培养箱、KYC-100B 型恒温培养振荡器，上海圣科仪器设备有限公司生产；MJ-78A 型高压蒸汽灭菌锅，上海巴玖实业有限公司生产；RZ-2D2G 型双人桌面（水平）净化工作台，广州瑞智净化设备有限公司生产；Essentia LC-15C 型高效液相色谱仪，岛津（中国）公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 栽培种的培养 称取300 g马铃薯，去皮切成小块，加适量蒸馏水煮沸30 min，用四层纱布过滤取滤液。向滤液中加入1.5 g 硫酸镁、3 g 磷酸二氢钾、10 mg 维生素B1、20 g 葡萄糖，用蒸馏水定容至1000 mL。将液体培养基分装于8 个200 mL 锥形瓶中，每瓶加入20 粒0.6 cm 的玻璃珠，于121℃下灭菌20 min。灭菌完毕的培养基放入培养室，于22℃下预培养3 d，确认培养基没有被杂菌污染，便可进行栽培种的接种。

在超净工作台中，挑取黄豆粒大小的蛹虫草菌原种，接种于液体培养基。将接种好的锥形瓶，放置于摇床上进行避光振荡培养，设定温度为22℃，转速为120 r/min，3 d 后选出菌液澄清、菌球长势一致的栽培种继续培养，2 d后栽培种培养完成。

1.2.2 柞蚕蛹的预处理及接种方式的单因素试验 用流动的水将柞蚕蛹清洗干净，晾干表面的水，按表1的处理方式对柞蚕蛹进行预处理，采用注射法将培养好的栽培种菌液接种于蛹体，接种量为0.2 mL，注射部位为由尾部向上数第二节腹环处。通过考察栽培种对蛹体的感染率、柞蚕蛹完全僵化所需天数、子实体的萌发率、复合体的平均干重，确定较优的预处理方式。

利用高温高压方式对清洗好的柞蚕蛹进行彻底灭菌，按表1的不同方式进行接种，其中注射法与上述接种方法相同，浸泡法为将柞蚕蛹完全浸没于栽培种菌液5 s；共培养法可免去接种的步骤，就是将柞蚕蛹预先置于液体培养基中，然后进行栽培种的接种与培养，随着菌种的生长，菌丝体不断侵入蛹体，当栽培种培养完成后，接种也随之完成。同样考察上述几个指标，以确定较优的接种方式。

表1 蛹虫草菌感染柞蚕蛹的方法

1.2.3 正交试验设计 利用正交试验设计对灭菌温度、接种时的浸泡时间、液体培养基中柞蚕蛹浸提液的含量这3个因素进行3水平的设计。L9（34）的9组正交试验中因素与水平的设计见表2。以复合体中虫草素的含量为指标，优化培育方法。

表2 正交试验因素水平表

1.2.4 栽培管理 将接种好的柞蚕蛹置于培养瓶中，在恒温培养箱内，于17℃培养3～7 d，后进入提温增菌阶段，将温度调整为24℃，继续培养，使蚕蛹完全僵化。然后将培养瓶转移到培养室，进行昼夜温差刺激培养，日间给予600 lx 的光照12 h，温度设定为22℃，夜间避光12 h，温度设定为16℃，空气相对湿度保持在60%～70%，培养10 d 后原基开始形成。随后进入发草阶段，昼夜给予600 lx的光照，温度固定在22℃，为保证新鲜空气的流通，将瓶口拧松，空气相对湿度保持在80%～90%，以利于子实体的成长。当子实体尖端稍有膨大时，即可进行采收。

图1 虫草素标品的高效液相色谱图

1.2.5 成品的采收与加工 将培养好的柞蚕蛹虫草复合体从培养瓶中取出，放入烘箱于60℃干燥2 h，取出进行整理，理顺子实体后，于40℃继续干燥4 h。烘干完成后，将柞蚕蛹虫草复合体置于避光、阴凉、通风处彻底风干，避光保存。

1.2.6 虫草素的提取 将柞蚕蛹虫草复合体粉碎，过80 目筛，精确称取2 g 样品粉末，用50%的乙醇作为溶剂，以1∶50 的料液比，在80℃下，超声波处理20 min（功率48 W），80℃水浴浸提10 min，重复4次，总计提取2 h。抽滤，收集滤液并以15%的甲醇定容至250 mL容量瓶。

1.2.7 虫草素含量测定 标准曲线的绘制:精确称取10 mg 虫草素标准品（按实际含量折算），以15%的甲醇定容至25 mL 容量瓶，得到质量浓度为0.4 mg/mL的虫草素标准品储备液[13～16]。利用储备液分别配制质量浓度为4 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、100 μg/mL的标准品溶液，分别将其过0.22 μm 微孔滤膜后进行高效液相色谱测定，根据标准品出峰时间（图1）确定虫草素的保留时间为19.743 min，以标准品浓度为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（图2），标准曲线方程为y=34975x+46048（R2=0.9993）。

色谱条件:色谱柱为C18 柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相为甲醇∶水=15∶85；流速，0.8 mL/min；柱温，25℃；检测波长，260 nm；进样量，10 μL。

产品中虫草素的测定:对产品进行5 次重复提取，分别在以上条件下进行虫草素含量测定，虫草素含量=（提取液中虫草素浓度×提取液总体积）/产品粉末质量。

图2 虫草素标准曲线

2 结果与分析

2.1 柞蚕蛹的预处理对蛹虫草培育的影响经统计发现（表3），在4 种预处理方法中，升汞（A2）的灭菌效果最佳，接种的100 个柞蚕蛹中，仅有1 个被杂菌感染，其余均僵化变硬，僵化率最高，达到了99%；不经预处理（A4）的柞蚕蛹，出现坏蛹较多，僵化率最低，仅为86%；但从蛹体僵化所需的时间、子实体是否萌发、复合体生长情况来看，利用高温高压（A1）进行预处理的效果最佳，接种后，虽然僵化率略低于A2处理，但蛹体完全僵化所需时间最短，仅为6 d，僵化的所有柞蚕蛹均萌发产生子实体，发草率高达100%，并且子实体长势健壮、颜色金黄，蛹体呈棕色，没有明显的发黑现象（图3），复合体平均干重在4种处理中最高，为3.54 g。

表3 灭菌、消毒方式对蛹虫草培育的影响

图3 4种不同预处理方法培育出的柞蚕蛹虫草复合体

表4 接种方式对蛹虫草培育的影响

图4 利用3种不同方法进行接种，培养6 d后菌丝体的生长情况

由此可见，升汞灭菌法（A2）虽然可以起到较好的防止杂菌感染柞蚕蛹的效果，但由于重金属汞对蛹体毒害较大及残留难以清除干净，子实体的萌发及生长均受到较大影响，不如其他3种预处理方式；新洁尔灭消毒法（A3）虽然在一定程度上可以防止杂菌的感染，但同样会对子实体的萌发产生影响；而对不经消毒、灭菌处理（A3）的柞蚕蛹接种后，开放性创口形成，蛹体较易被杂菌感染，引起了坏血蛹的出现，因此确定高温高压灭菌法为较优的预处理方式。

2.2 接种方式对蛹虫草培育的影响经统计发现（表4），浸泡法（B1）、共培养法（B2），可以较好的避免因注射等复杂操作对蛹体造成的杂菌感染，所接种的柞蚕蛹均僵化变硬，僵化率达100%；采用共培养法（B2）进行接种时，柞蚕蛹在蛹虫草菌栽培种的培养过程中就与其接触，栽培种在扩大生长时就不断地侵入蛹体，因此蛹体完全僵化时间明显短于其它2 种接种方式，仅为3 d，但由于菌丝体在蛹体中生长时间过长，菌龄老化（图4）等原因的影响，子实体萌发效果最差，发草率仅为89%；浸泡法（B1）不但操作简便，不易引起杂菌感染，而且对子实体的萌发、生长无不利影响，因此确定为较优的接种方式。

2.3 培育方法的优化以复合体中虫草素的含量（图5）为指标，对利用无菌柞蚕蛹培育蛹虫草的相关参数进行正交试验优化。结果表明（表5），在该方法中，影响柞蚕蛹虫草复合体中虫草素含量的主次因素，排序为灭菌温度＞浸提液含量＞浸泡时间。考察这几个因素在3 个水平上的变化，确定较优方案为A2C2B1，即在栽培种的液体培养基中，按50%的比例添加柞蚕蛹浸提液，在115℃的温度下对柞蚕蛹进行高温高压灭菌，以将蛹体浸泡于栽培用菌液中10 s的方式来接种。

表5 正交试验直观分析表

图5 柞蚕蛹虫草复合体中虫草素的高效液相色谱图

在对正交试验结果进行方差分析时，选取空列D作为误差项，在α=0.05的条件下进行F检验，方差分析结果表明（表6），灭菌温度和浸提液含量对柞蚕蛹虫草复合体中虫草素的含量具有显著性影响，他们的改变在一定程度上可以影响蛹虫草的品质。可见，灭菌温度为115℃时，既可以起到较好的灭菌效果，又不会因为温度过高导致蛹体中的营养物质被过多破坏，而影响蛹虫草的生长；同时，以50%的比例向栽培种培养基中添加柞蚕蛹浸提液，可以起到使蛹虫草菌适应柞蚕蛹营养成分的过度作用，为蛹虫草菌侵入蛹体后的快速、稳定生长发挥促进作用。

表6 正交试验方差分析表

3 小 结

利用无菌柞蚕蛹进行蛹虫草的培育，必然会减轻甚至完全消除杂菌的影响，增强蛹虫草菌对柞蚕蛹的感染能力。结合操作简便的浸泡法进行接种，尽量简化中间步骤，可有效避免坏蛹的出现，使柞蚕蛹的僵化率达到100%。当以高温高压法作为灭菌方式时，在杀灭杂菌的同时，柞蚕蛹也被杀死，其机体当中能够抵抗外来菌群侵染的免疫力也随之消失，这可能就是利用该方法进行蛹虫草培育时，蛹体完全僵化所需时间大大缩短的原因。同时，由于高温的作用，可能会使柞蚕蛹中富含的蛋白质降解为蛹虫草菌更易于利用的氨基酸，从而使子实体的萌发率可提高至100%且长势强健。研究确定的较优方法，既缩短了蛹虫草的培育周期，又提高了产品的品质，可为蛹虫草工业化快速生产，提供一种新的技术支持。