蛹虫草高产优良菌株的选育

王艳华 徐国华 李剑梅 韩 冰 杨泽涛 修翠娟

（1 辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000）

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草，蛹草，北虫草，蛹草菌。隶属子囊菌门、核菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，是虫草属的模式种[1]。蛹虫草含有丰富的虫草素、虫草酸、虫草多糖，微量元素硒等，具有增强动物机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗菌、抗氧化等多种生理功效，是一种能同时平衡和调节阴阳的食药用真菌[2～4]。

蛹虫草菌株非常容易变异和退化，保存期短，生产菌种需要不断的进行重新筛选，菌种筛选工作繁重艰巨，所以有效科学的蛹虫草优质高产栽培菌株的筛选方法的建立显得非常重要。笔者进行了圆头及尖头蛹虫草菌株分离选育鉴定方法探索，现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料新鲜蛹虫草子实体（图1、图2），来自内蒙古敖汉北虫草农民专业社。

图1 圆头蛹虫草子实体

图2 尖头蛹虫草子实体

1.2 培养基①斜面培养基配方:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾0.1 g，硫酸镁0.1 g，琼脂20 g，加水1000 mL。②栽培培养基配方:麦粒35 g，营养液60 mL。

1.3 试验方法蛹虫草菌株分离包括组织分离和孢子分离两种。两种方法可结合使用，最后对筛选出的菌株进行鉴定比较，筛选出优良菌株进行下一步栽培生产。

1.3.1 组织分离 用无菌刀将虫草子实体切成长度1～2 mm 的小段，接种于PDA 试管或平板固体培养基上，放置在18～20℃的恒温培养箱中培养。

培养48～72 h，菌丝开始萌发，在组织块周围长出白色放射状的菌丝，及时选择无污染的菌丝体，接种于新的培养基上进一步培养，最终得到纯化的蛹虫草菌株。

组织分离消毒与否对比试验:取新鲜、生长正常的蛹虫草子实体，先用清水冲洗，再置于75% 酒精浸泡消毒2～3 min，取出以无菌水反复冲洗2～3次，放在无菌器皿内备用。

按照组织分离方法进行分离培养，最终得到纯化的蛹虫草菌株。

不消毒:采用无菌操作直接用鲜蛹虫草子实体培养菌丝体。

1.3.2 孢子分离 孢子分离方法更多地适合圆头蛹虫草菌株的筛选，尖头蛹虫草依品种的不同而有所差异，有的尖头蛹虫草品种可以采集到孢子，有的子实体很难产生大量孢子。

孢子分离筛选优良菌株比组织分离得到的优良菌株的比例小，工作量较大。

2 结果与分析

2.1 不同部位组织分离效果试验结果，组织块截取部位越靠下，菌丝体（尖头蛹虫草）生长越差，转色变差，生物学转化率降低或不出草。试验结果表明上部1.5 cm以内组织块分离出的菌种相对能保证转色出草。但在试验中也发现不同批次的子实体即使生长周期相同，有的上部1.5 cm 以内的组织分离出的菌种可转色出草，有的3～4 cm 的组织部位分离出的菌种仍可较好地转色出草，说明不同批次不同株型的子实体具有不同的生长遗传特性。

圆头草的组织分离要选取孢子头膨大部位组织体，头柄相接处及柄部的组织体处分离出的菌株出草性状不好，不宜采用。试验结果表明，圆头蛹草子实体组织用酒精消毒后，培养生长出的菌丝体相比未经酒精消毒的菌丝体转色差（图3），出草也差。而尖头蛹虫草未出现上述情况。

2.2 组织是否消毒对分离效果的影响结果表明不管是尖头蛹虫草还是圆头草蛹虫草，只要子实体新鲜无感染，草龄适宜，组织不消毒分离培养出的菌丝体生长旺盛，转色及出草均正常。但由于蛹虫草子实体组织体小，在分离过程中要严格无菌操作，避免二次人为污染。

2.3 分离蛹虫草菌株鉴定分离得到的蛹虫草菌株必须要进行菌株鉴定，以确定得到的菌株是否是优质高产北虫草菌株，只有经过鉴定的优良菌株才可以应用到生产中。菌株鉴定包括直接观察法、镜检法、出草试验等（分子DNA鉴定省略）。

2.3.1 直观法 直观法就是靠人的肉眼进行直接观察，对蛹虫草菌丝生长情况、见光转色情况、出草情况等进行观察比较，并定期记录。

蛹虫草菌丝体在PDA 固体培养基上的培养观察。一般来说，蛹虫草菌丝体在第2、3 天可观察到，第4、5天生长较好，优良的蛹虫草菌株在培养初期菌丝为白色，粗壮浓密，呈绒毛状，边缘整齐，匍匐状紧贴培养基生长，菌落生长旺盛。受光线刺激的管壁与基质结合处呈现黄色（图4）。

图3 消毒与否圆头蛹虫草组织分离菌丝体转色情况

图4 蛹虫草菌体在PDA固体培养基上的生长情况

2.3.2 斜面菌株见光转色及出草试验 见光转色试验是非常重要且简单的一步。优良的蛹虫草菌株菌丝体培养后期见光后，受光线刺激与基质结合处呈现黄色。随着时间的延长，由黄色逐渐变成橘黄色（图5）。见光后转色不好或完全不转色，这样的菌株完全不能用于生产，生物学转化率非常低或完全不出草，通过这一步可直接淘汰掉性状差的菌株。优良的菌株可在斜面观察到出草现象，转色越快，颜色越深的菌株，出草越早，生物学转化率也越高。

优良的尖头蛹虫草菌株转色很快，2 d以后就可以变为深橘黄色，5～7 d在斜面上可观察到有针刺状的高0.5～1 cm的子实体冒出（图6）。

优良的圆头蛹虫草菌株则转色后为浅橘黄色，约10 d后培养基表面可见有针刺状子实体冒出（图7）。

2.3.3 镜检结果 用显微镜检查菌丝生长情况及菌种纯度，有无杂菌。通过镜检法还可以进行分生孢子产孢特性与其可育性关系观察。

蛹虫草菌丝光滑，有隔及分枝，后期形成分生孢子。在人工培养基上产生拟青霉型（Paecilomycestype）和轮枝孢型（Vertillium-type）2种产孢结构（图8、图9）。一些实验证实同时具有这2种产孢结构的菌株，其子实体形成能力可以保持许多代，性状不再变异，遗传性状相对稳定，可结合观察分生孢子产孢结构进行菌株复筛[5]。

图5 分离的不同菌株见光转色情况

图7 优良圆头蛹虫草菌株斜面转色

图8 蛹虫草菌丝体细胞

图9 轮枝孢和拟青霉混合型

2.4 选择性培养驯化对菌株进行选择性驯化培养，如选择不同的培养基，高、低温刺激等。观察菌株的生长性状及其抗逆能力，选择保留抗逆性强的菌株，这样的菌株生产性能更加优良。

2.5 栽培出草试验在进行大规模生产前，对初筛的性状优良的菌株必须要进行小规模栽培出草试验，在玻璃瓶中进行即可，小规模出草试验成功后才可进行真正的规模生产。

接种后生长速度快，出草整齐，草形好，生物学转化率高的菌株可作为优良的生产用菌株。

3 小结与讨论

蛹虫草菌株非常容易退化，保藏期很短，菌种筛选工作非常繁重。试验对尖头及圆头蛹虫草优良菌株分离选育，通过直接观察法简单且直观初步去掉劣势菌株，筛选出初级优良菌株，减少了后续试验时间及工作量；镜检法、出草试验结合进一步确认筛选出菌株优良性。试验建立了一套蛹虫草优质高产栽培菌株的筛选方法，对蛹虫草菌株的选育工作具有一定的指导作用。

蛹虫草高产菌株的筛选有许多关键因素，筛选出优良菌株后，菌株的保藏条件、保藏时间，传代复壮次数等都对蛹虫草的生长有至关重要的影响[5，6]。

由于蛹虫草的种类多、分布广，其生长条件存在着一定的差异，菌丝体的分化也有一定的差异，菌株筛选方法也会有所不同。