骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑血管病的研究进展

邢海会，谢菊华，张素君，罗崟洲，陈丰洋，丁晓慧*

骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑血管病的研究进展

邢海会1，谢菊华2，张素君3，罗崟洲4，陈丰洋4，丁晓慧2*

（1.沈阳医学院基础医学院人体解剖与组织胚胎学专业2015级硕士研究生，辽宁沈阳110034；2.组织与胚胎学教研室；3.麻醉学专业2012级3班；4.临床医学专业2015级2班）

缺血性脑血管病为脑血管疾病的多发病，临床治疗效果并不理想，探索缺血性脑血管病的最佳治疗方法成为了临床与基础研究的热点。骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是一类具有多分化潜能的干细胞，在缺血性脑血管病治疗上具有广阔的应用前景。本文对BMSCs的来源与生物学特性、分离与纯化、移植途径、时机和数量及其在动物模型与临床治疗上的应用进行综述，以深入认识BMSCs移植在治疗缺血性脑血管病中的重要作用。

骨髓间充质干细胞；移植；治疗；缺血性脑血管病

缺血性脑血管病是指由于脑的供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。在所有脑血管病中，缺血性脑血管病占87%多［1］。缺血性脑血管病死亡率高，致残率高，在幸存者中约3/4患者遗留痴呆、偏瘫、失语等后遗症状，部分患者丧失劳动能力和生活能力。随着中国人口老龄化进程的不断加剧以及该疾病发病的年轻化，缺血性脑血管病已成为严重的公共卫生问题和社会经济问题。虽然目前临床上对该病的治疗方法较多，如溶栓、抗凝、营养神经等，但这些方法均不能从根本上修复受损脑组织。因此，探寻更有效的治疗方法成为临床与基础研究的热点与难点。骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是一种多分化潜能的干细胞，具有分化为神经细胞的潜能，在缺血性脑血管病治疗上具有广阔的应用前景［2-5］。现就BMSCs治疗缺血性脑血管病的研究进展进行综述。

1 BM SCs

1.1 BMSCs的来源与生物学特性有研究证实所有鼠科动物的器官或组织中都存在有BMSCs［6］，任何组织均需要保留其祖细胞来补充自身细胞的凋亡和促进自身细胞的更新［7］。但目前BMSCs主要来源于骨髓，在骨髓中的含量为0.001%～0.01%，且随着年龄的增加逐渐减少［8-9］。此外，从成年人的脂肪组织、肝脏、牙髓，以及脐血、胎盘和羊膜中也均可分离获得BMSCs［10-14］。BMSCs在生理稳态下增殖并不明显，但在富含血清的培养环境中可贴壁生长并形成集落［15］，表现出很强的自我更新和增殖能力，并在一定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其它类型的细胞等［12，16-17］。BMSCs在动物及人体组织中具有易获得、多向分化、无免疫排斥等优点，使得其常作为种子细胞被广泛应用于科学研究中。

1.2 BMSCs的获取、分离与纯化目前实验研究用BMSCs最常从大鼠或小鼠中获取，具体方法即将动物麻醉或脱颈处死后，将其置于75%的酒精中5 min，在无菌条件下分离其股骨和胫骨后，剪去两端骨骺，用注射器抽取含10%胎牛血清的完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头变白，随后收集冲洗后的BMSCs悬液，采用全骨髓贴壁法或密度梯度离心法于37℃、5%的CO2培养箱中培养。而对BMSCs分离、纯化主要采用全骨髓贴壁法或密度梯度离心法。全骨髓贴壁法是根据干细胞的贴壁生长特性，通过定期换液的方法去除不贴壁的细胞即造血细胞等来达到分离纯化BMSCs的目的。密度梯度离心法则是用一定的介质即淋巴细胞分离液在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞悬液或匀浆置于分离液的顶部，通过重力或离心力的作用使细胞分层分离，因为BMSCs是有核细胞，属于单核细胞层，故抽取离心后中间的云雾状单核细胞层，经洗涤和离心后，弃上清，胎牛血清重悬细胞并计数细胞密度和培养细胞。全骨髓贴壁法操作相对简单、对细胞活性损伤小，可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的BMSCs［18-21］，但也有研究证实全骨髓贴壁法联合其它方法比单纯使用全骨髓贴壁法更方便、快捷、有效［22-23］，用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合可以有效分离、纯化人BMSCs［24-27］；目前临床上也常采用密度梯度离心法和贴壁法相结合的方式分离培养人BMSCs。

随着流式细胞仪等实验技术的开展与成熟，流式细胞分选BMSCs法和免疫磁珠法也获得了一定范围的应用，但其应用因技术要求高、分离过程繁琐、对细胞活性影响大等缺点及尚未找到BMSCs的特异性抗原等因素而受到限制。

1.3 BMSCs的移植途径、时机和数量如何将BMSCs移植到损伤部位并在宿主内正常存活分化，是BMSCs治疗缺血性脑血管病的前提和关键。目前多数学者证实BMSCs可通过立体定向（纹状体或侧脑室）、血管内（动脉或静脉）或经腰椎穿刺注入蛛网膜下腔等途径进行移植，但哪种途径最优尚未有统一的定论。有研究报道立体定向途径优于静脉移植途径［28］。但是由于可行性及立体定向过程中对脑可能造成的继发性损害等因素导致该途径目前仍不能被诸多患者所接受。而动静脉途径虽有其独特的优势但也有移植所需细胞数量多、易被其他器官所摄取且不易透过血脑屏障等弊端而应用受限。蛛网膜下腔移植既具有可避开血脑屏障的障碍，又有利于BMSCs进入脑内等优点，可能是最易被患者所接受的移植途径。

选择合适的时机和数量对移植BMSCs至关重要。移植过早、数量过多不利于BMSCs正常存活和发挥作用；移植过晚、数量过少也不能及时挽救脑缺血症状而达到治疗的目的。有动物研究认为在脑缺血再灌注损伤动物模型7 d后为最佳移植点，但将其广泛地运用于临床还需大量的数据去进一步验证［29］。

2 BM SCs移植治疗缺血性脑血管病的应用现状

2.1 BMSCs移植在缺血性脑血管病动物模型中的应用近期研究发现，用缺氧/复氧预处理的人BMSCs和未经处理的正常BMSCs分别与缺血大鼠皮层神经元共同培养，缺氧/复氧预处理的BMSCs能促进缺血大鼠皮层神经元的存活，增强其促生存信号、营养因子释放和细胞迁移，具有挽救缺血皮层神经元的能力，对脑缺血具有治疗作用［30］。Sun等［31］将用异氟醚预处理后的BMSCs移植到脑缺血再灌注损伤小鼠模型后观察发现，异氟醚预处理可增加BMSCs植入缺血脑组织的数量并促进缺血脑组织功能的恢复。Hideo等［32］在建立小鼠永久性局灶性脑缺血模型7 d后，采用立体定位仪将BMSCs移植到缺血侧纹状体，在移植2或4周取脑，进行荧光原位杂交和免疫染色分析，结果发现移植2周后大约一半的BMSCs表达脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）mRNA，但是其后BDNF和NGF mRNA的阳性细胞百分率下降；在移植4周后，微管蛋白-2（神经元标志物）表达阳性的BMSCs逐渐升高。这一发现表明BDNF可能是BMSCs发挥营养作用的一个关键因素，在缺血性脑血管病早期行干细胞疗法进行BMSCs移植对缺血的脑组织具有营养作用。

同时早期研究证实在脑缺血1 d后经纹状体移植的BMSCs可显著增加成年大鼠皮质缺血区半暗带轴突出芽和髓鞘的再生［33］。刘敬霞等［34］也发现BMSCs移植对大鼠脑缺血再灌注损伤组织神经轴突再生具有一定促进作用。移植的BMSCs可以迁移到缺血区表达神经细胞表型或通过刺激缺血区各种生长因子的表达，减少神经细胞的凋亡、刺激血管的生成、重建突触和树突、增加轴突的再生以及内生性神经干细胞的分化来促进脑功能的修复。此外，也有研究证实由BMSCs分泌的细胞因子还具有免疫调节、血管生成、抗炎和抗凋亡效应［35］。

2.2 BMSCs移植在临床治疗缺血性脑血管病的应用目前BMSCs治疗缺血性脑血管病已逐步从基础研究转至临床实践，并已成为治疗缺血性脑血管病的一大热点。据陈玉梅［36］报道，将临床上符合条件的患者根据自愿原则分为干细胞移植组和对照组（常规用药组），干细胞移植组在无菌条件下通过骨髓穿刺取自体骨髓经密度梯度离心法获取人BMSCs，经腰椎穿刺途径将分离培养后的BMSCs回输患者体内，神经功能NIHSS评分和BI指数评分评价治疗效果，结果发现，与对照组相比，进行自体BMSCs移植可显著改善脑梗死患者的神经功能缺损症状。谢旭芳等［37］也证实脑梗死患者自体BMSCs移植可显著改善其脑缺血后神经功能损伤。

越来越多的学者关注BMSCs移植的安全性问题。近期研究报道，对18例慢性脑卒中处于稳定期的患者移植经修饰的BMSCs（sb623细胞）12个月后观察发现，sb623细胞移植安全性良好，可显著改善脑卒中患者的神经功能［38］。Díez-Tejedor等［39］将20例出现急性缺血性脑卒中的患者随机分为试验组和对照组，试验组在患者出现脑卒中症状后的第1个2周内静脉注射脂肪源性BMSCs，对照组给予同等剂量的安慰剂，患者在治疗后随访2年以评估BMSCs给药方式的安全性和有效性以及其在治疗方面对脑组织的保护作用和修复潜能，目前此项研究正处于Ⅱ期临床实验，尚未得到最终结局。尽管BMSCs移植的安全性问题已在一些研究中得到证实，但是BMSCs仍存在有很多尚未解决的问题。BMSCs的自我更新和增殖潜能有类似于肿瘤细胞的特征，是否存在有致瘤性的可能为移植安全性的一大隐患。虽然BMSCs移植在短期内未见有不良反应的报道，但其移植后的长期不良反应还有待于时间去进一步验证，这些问题都将制约着BMSCs移植的广泛运用。

3 小结

BMSCs具有来源广泛、易分离获得、易培养、多向分化潜能、移植不存在伦理学争议等优点，在缺血性脑血管病治疗上具有广阔的应用前景。目前大量动物研究已经证实BMSCs对缺血脑组织神经再生、损伤修复均有一定促进作用，同时也有报道BMSCs移植对脑梗死患者具有治疗作用。但将其广泛地应用于临床治疗中还面临着诸多挑战，比如BMSCs移植的途径、时间和数量还未有统一的标准；移植后潜在的不良反应对治疗效果的影响等，这些将制约BMSCs移植在临床上的广泛运用。而这些问题的解决，将为临床实施BMSCs治疗缺血性脑血管病提供新的思路和目标。

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Re s e a r c hPr o g r e s so fT r a n s p l a n t a t i o no fBo n eM a r r o w St r o ma lCe l l si nt h eT r e a t me n to fIs c h e mi c Ce r e b r o v a s c u l a r D i s e a s e

XING Haihui1，XIE Juhua2，ZHANG Sujun3，LUO Yinzhou4，CHEN Fengyang4，DING Xiaohui2*
（1.Postgraduate of Grade 2015，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Histology and Embryology；3.Class 3，Grade 2012；4.Class 2，Grade 2015）

Ischemic cerebrovascular disease is a frequently occurring disease，and the clinical therapeutic effect is not ideal.To explore the best treatment method of ischemic cerebrovascular disease becomes a hot spot in clinical and basic research.Bone marrow stromal cells are a kind of stem cells with multiple differentiation potential，which has broad application prospects in the treatment of ischemic cerebrovascular disease.This paper briefly reviews the sources and biological characteristics，separation and purification，transplantation approaches，timing and quantity of the bone marrow stromal cells and application in animal model and clinical therapy，which will help us to understand the role of bone marrow stromal cells in the treatment of ischemic cerebrovascular disease.［Keywords］bone marrow stromal cells；transplantation；treatment；ischemic cerebrovascular disease

R743.3

A

1008-2344（2017）02-0167-04

2016-08-08

（文敏编辑）

沈阳医学院大学生科研课题（No.20150806）；辽宁省大学生创新创业训练项目（No.201510164000006）；国家级大学生创新创业训练项目（No.201510164006）；辽宁省教育厅课题（No. L2014406）

丁晓慧（1971—），女（汉），教授，博士，研究方向：心脑血管缺血性疾病.E-mail：1285448068@qq.com

d o i：10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.029