超声造影在肿瘤化疗模型中诊断价值的初步探索

周世崇，常 才，乐 坚，范亦武，陈 敏

复旦大学附属肿瘤医院超声诊断科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

目前，国内女性恶性肿瘤中乳腺癌发病率居第1位[1]。新辅助化疗在其治疗中应用日益广泛[2]，但疗效评估仍依赖最终病理分级。现有影像学技术可监测肿瘤在化疗前后的大小变化，但无法在化疗早期预测最终疗效[3-4]。现有研究显示，肿瘤可促进大量新生血管产生，这是其生长、侵袭和转移的基础[5]。超声造影剂具有纯血池灌注特性，本研究拟通过超声造影观察化疗前后肿瘤血供改变，以达到早期预测化疗疗效的目的。

1 资料和方法

1.1 研究对象

实验动物为无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级BALB/c裸鼠，雌性，4周龄。人乳腺癌细胞株MCF-7来自复旦大学附属肿瘤医院中心实验室。取对数生长期细胞，制成密度约为2×107/mL的细胞悬液。于每只裸鼠右侧胸壁乳垫下注射接种0.3 mL细胞悬液，诱导裸鼠产生乳腺癌。接种后连续观察1周，以接种部位皮下出现肿瘤结节、质地较硬等指标认为成瘤。4周后，瘤体长至直径约2.0 cm时进一步实验。

将荷瘤裸鼠按完全随机法分成实验组和对照组，每组30只。每组再按给药时间点分成3个亚组，每个亚组10只。化疗前组：不给药，第1天给药前处死。化疗1次组：第1天给药，第7天第2次给药前处死。化疗2次组：第1、7天贯序给药，第14天处死。各亚组小鼠于处死前称量体质量，测量肿瘤长径及短径，肿瘤体积换算公式=长径×短径2/2。

1.2 化疗方案

实验组给药方案C M F：环磷酰胺(cyclophosphamide，C)+甲氨蝶呤(methotrexate，M)+氟尿嘧啶(fluorouracil，F)。给药剂量严格依据Lloyd等的实验设计[6]，单药剂量为2/3 LD10。各药LD10剂量具体如下[7-9]：环磷酰胺100 mg/kg，甲氨蝶呤27 mg/kg，氟尿嘧啶140 mg/kg。模拟临床给药方案CMF。在实验组亚组给药的同时，相应对照组亚组给予生理盐水，均为腹腔注射。

1.3 仪器与方法

全部实验动物于处死前进行超声造影检查。使用意大利Esaote公司MyLab90多普勒彩色超声诊断仪，探头频率8～12 MHz。超声造影剂为意大利Bracco公司SonoVue，每只裸鼠通过尾静脉注射0.005 mL。注射后立即进行造影观察，记录数据。造影结束后于探头下置入定位针，确定观察区域。采用德国TomTec公司分析软件SonoLiver脱机分析造影数据，获取以下造影参数：肿瘤灌注峰值强度(maximum intensity，IMAX)，即造影剂灌注达峰时对比对照区域的强度值；上升时间(rising time，RT)，即灌注从峰值10%至90%强度所需时间；灌注达峰时间(time to peak，TTP)，即从开始灌注至达峰所需时间；平均渡越时间(mean transit time，mTT)，即病灶峰值强度下降一半所需时间。

全部裸鼠于置入定位针后脱颈处死，沿探头方向剖开瘤体，取定位针所在厚度约5 mm、长度包含全部造影瘤体的组织，固定后石蜡包埋切片。检测微血管密度(microvascular density，MVD)，血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)-1/2/3。将实验组中化疗前亚组和2次化疗亚组的肿瘤标本切片，于光学高倍镜下进行肿瘤细胞计数。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 肿瘤物理指标

肿瘤生物指标包括荷瘤裸鼠体质量、肿瘤体积(表1)。第1次给药后：体质量组间对照(P=0.000)和组内对照(P=0.000)差异均有统计学意义；肿瘤体积组间对照(P=0.000)差异有统计学意义，组内对照(P=0.539)差异无统计学意义。第2次给药后：体质量组间对照(P=0.000)和组内对照(P=0.000)差异均有统计学意义；肿瘤体积组间对照(P=0.000)差异有统计学意义，组内对照(P=0.46)差异无统计学意义。

2.2 肿瘤微循环指标

微循环指标包括MVD、VEGFR-1/2/3(表2)。第1次给药后：MVD组间对照(P=0.138)和VEGFR-3组间对照(P=0.069)差异无统计学意义，组内对照(P=0.205)差异无统计学意义；VEGFR-1组间对照(P=0.008)显著下降，VEGFR-1组内对照(P=0.007)显著下降。第2次给药后：MVD组间对照(P=0.000)和VEGFR-3组间对照(P=0.003)显著下降，MVD组内对照(P=0.004)显著下降；VEGFR-1组间对照(P=0.000)显著下降，VEGFR-1组内对照(P=0.000)显著下降。镜下切片见图1～2。

2.3 超声造影指标

超声造影指标包括IMAX、RT、TTP和mTT(表3)。第1次给药后：IMAX组间对照(P=0.001)和组内对照(P=0.000)显著下降；TTP组间对照(P=0.427)和组内对照(P=0.376)差异无统计学意义。第2次给药后：IMAX组间对照(P=0.000)和组内对照(P=0.000)显著下降；TTP组间对照(P=0.001)和组内对照(P=0.001)显著上升。超声造影见图3～5。

表 1 肿瘤生物指标

2.4 病理结果

在光学显微镜40倍物镜下计数，化疗前实验组肿瘤细胞密度为464.92±60.85/HF，2次化疗后实验组肿瘤细胞密度为136.99±17.3/HF，化疗后肿瘤细胞显著减少(P=0.000)。

表 2 肿瘤微循环指标

表 3 超声造影参数

图 1 实验组化疗前、化疗1次、化疗2次的MVD镜下切片

图 2 实验组化疗前、化疗1次、化疗2次的VEGFR-1镜下切片

图 3 化疗前肿瘤超声造影图

图 4 化疗1次后的肿瘤超声造影图

图 5 化疗2次后的肿瘤超声造影图像

3 讨 论

目前，超声造影预测抗血管生成药物疗效的研究比较多。有研究报道[10-14]，在动物肿瘤模型中使用抗血管生成药物，伴随着肿瘤微循环指标降低，超声造影参数出现不同程度的改变，部分研究认为超声造影参数与抗血管疗效相关。然而，临床使用的大部分化疗药物主要通过抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成来抑制肿瘤生长，作用机制不同于抗血管药物。有研究报道[15-16]，超声造影在新辅助化疗前后曲线有显著变化，但缺乏足够的量化参数。有研究报道[17-19]，单独使用化疗药物如顺铂或阿霉素，可观察到肿瘤的微循环指标改变，且伴有超声造影参数变化，但他们没有研究早期变化与肿瘤化疗疗效的关系。本研究模拟临床联合化疗方案，探讨用药后肿瘤微循环指标的改变及超声造影指标的改变，并分析两者的关系。

本研究中，MVD在第2次化疗后的组内和组间出现显著下降，与既往报道[17-19]吻合。进一步研究发现，VEGFR-1在首次化疗后组内和组间即出现显著下降，提示作为微循环指标，其可能比MVD对化疗药物更敏感。2次化疗后，肿瘤细胞下降70%以上，按病理MP分级，属不完全缓解中的3级。浸润癌细胞的降低达30%～90%，属中度减少。由此可见，肿瘤细胞被化疗灭活的同时，出现了显著微循环改变。

第2次化疗后TTP在组间和组内均显著上升，提示肿瘤灭活后灌注时间延长，很可能是微循环受到破坏所致。对比病理结果，肿瘤体积在2次化疗后较化疗前未出现显著变化，而部分微循环指标和部分造影指标出现显著变化，两者具有一致性，均早于肿瘤物理体积的变化。

在乳腺癌新辅助化疗模型中，超声造影部分指标变化与肿瘤微循环指标变化具有一致性，均早于肿瘤物理体积变化。虽然尚未证实两者相关，但值得进一步深入研究。

本研究存在以下不足：样本量相对较小，无法进行相关性分析；仅模拟了一种新辅助化疗方案；MCF-7细胞也不能体现乳腺癌免疫组化和基因分型的多样性。

综上所述，超声造影参数IMAX和TTP在化疗过程中，与肿瘤微循环指标MVD和VEGFR-1的变化具有一致性，提示超声造影具备了预测新辅助化疗疗效的潜力。

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