硅藻量化研究的法医学探讨

刘泉，柯技，王树法

1.湖北警官学院，湖北武汉 430034；2.湖北三真司法鉴定中心，湖北武汉 430034

硅藻量化研究的法医学探讨

刘泉1,2，柯技1,2，王树法1,2

1.湖北警官学院，湖北武汉 430034；2.湖北三真司法鉴定中心，湖北武汉 430034

硅藻量化研究有助于提高硅藻判断生前溺死的准确性。全文通过分析了几种硅藻的常用检验方法、消化方式、富集方式的优缺点，探讨了硅藻量化的最佳检验方法和步骤；同时，还探讨了影响硅藻数量的环境因素问题，并针对这些问题提出了相应的解决对策，为硅藻量化研究检验条件的优化提出了自己的见解。

硅藻；量化；溺死；法医学

硅藻是一种广泛存在于各种水域中的单细胞生物，自1904年首次被人在溺死尸体肺组织内检出后，逐渐成为溺死死亡诊断的重要手段[1]。有人通过实验发现，非溺死者的内脏中也有硅藻，从而对硅藻诊断溺死提出异议[2]。但大量实验表明，非溺死者与溺死者内脏硅藻数量存在显著差异[3-4]，所以目前硅藻的检验仍不失为一种鉴别生前溺死与其它死因的有效手段。在实际工作中，依靠硅藻诊断生前溺死需结合案情及尸体检验情况，但水中尸体常常高度腐败，这类案件又可能因种种原因无法得到有效的案情，这就导致需要单纯依靠内脏里的硅藻来判断是否为生前溺死。那么内脏中硅藻应达到多少量，才能区别生前溺死与死后抛尸呢？硅藻的量化研究就是为了解决这一难题。目前有关这方面的研究已成为热点，笔者所在课题组在这方面也有了初步的实践。该文将对硅藻量化中涉及的硅藻检验方法的选择和硅藻量化影响因素等方面进行初步的探讨，以期为硅藻量化研究的法医学检验提出自己的建议。

1 硅藻的特点

硅藻无处不在，地球上凡是有水滞留的地方，几乎都能见到硅藻的踪迹。在显微镜下，硅藻是一种单细胞藻类，约有170个属5 500个物种。根据硅藻的形态，可以分为中心目硅藻和羽纹目硅藻。中心目硅藻大多分布于海洋中，壳面纹饰主要呈辐射状排列；羽纹目硅藻大多数分布于淡水中，壳面纹饰主要呈左右对称排列。硅藻体积非常小，直径约从1～200 μm，因此部分硅藻可随溺液进入体内，分布到全身各个器官。硅藻的结构具有特征性，除了少数的种类外，硅藻的细胞结构有两大特点，一个是细胞壁由两个似培养皿的半壁套合而成；另一个是细胞壁的成分高度硅质化，并形成有物种特征性的各种纹路[5]。硅藻细胞壁的主要成分是果胶质和硅质，果胶质位于内层，硅质位于外层。它的细胞壁硅质成分与法医息息相关，由于其主要是SiO2，不易受到外界因素的影响而破坏，因此可以在尸体中长期保存。这些特征使得硅藻对于晚期尸体生前溺水的诊断具有重要意义。

2 硅藻量化检验方法类别的选择

目前，用于硅藻检验的方法很多，这些检验方法综合起来大致分为3类：通过形态特征来识别硅藻的检验方法；通过特征性DNA片段来识别硅藻的检验方法；通过化学成分来识别硅藻的检验方法。这些方法都可以对硅藻进行定性检测，准确性已被大家公认。但要做硅藻的量化的检验，不仅要识别硅藻，还要能计数，即需要对检出的硅藻进行适度的定量，那么以上的方法就不全适用了。计数方式可以有相对计数或绝对计数。相对计数是指通过实际检测结果与理论值按百分比做的结果。在硅藻检验中，相对计数是实验人员通过将检测到硅藻的某个值与一个基本值作百分比而得出的结果。观察形态来计个数、测DNA的含量和测化学成分的含量等检验方法在理论上均可采用相对计数法。但实际操作中实施起来却有很多问题。首先，各种方法的基本值（即死后抛尸的人体内硅藻含量）是很难确定的。有些也许有少量生前吸入的硅藻，但更多的是没有硅藻。当基本值为0时，无法百分比化。其次，测DNA含量或化学成分的含量受很多实验操作方面的影响，比如PCR的内环境，循环次数等，这样就会造成同一样品多次检测结果之间存在差异的情况，稳定性较差。绝对计数是指按照实际看到的结果来计数。在硅藻检验中，绝对计数是指实验人员看到了多少个硅藻就是多少个，这种方式简单易行，但只适用于通过硅藻形态特征来识别的检验方法。通过DNA片段或化学成分来识别的检验方法，是间接识别，不能看到硅藻的形态，只能通过设备上的数字来分析读取，因此无法使用绝对计数法。另外，直接识别硅藻形态进行计数还可以方便的对不同类型的硅藻进行分类，有助于落水地点的判断。因此，通过硅藻形态特征来识别的检验方法更适合用于硅藻量化研究的检验，它能对看到的硅藻直接计数，有助于硅藻量化研究的开展。

3 通过形态特征识别硅藻的检验方法有关步骤的选择

3.1 几种消化方式的比较

通过形态特征来识别硅藻的第一步是将硅藻从内脏中提取出来。通常采取的方法是将可能存有硅藻的器官组织破坏，富集其中的硅藻。目前常用的方法有以下几种：强酸消化法、酶消化法、物理消化法和多方法联用。强酸消化法是指使用浓酸破除有机质，从而保留硅藻形态的消化方法。该方法有成本低、消化时间短、消化完全、便于开展等优点，目前为基层普遍采取的一种方式。尽管传统认为由于硅藻细胞壁有硅质，能抵御强酸的腐蚀，但在实践中有人发现通过强酸消化最后检测到的多是一些耐酸性的无机硅藻，而其他类型硅藻则被破坏[6]。为了提高检出率，有些法医工作者对基于强酸消化的方法进行了改良，主要通过减少强酸的用量和消化时间，增加其它类型的消化方式，以此来保留对酸较敏感的硅藻类型。但其依然有使用局限性：①使用酸，依然会破坏部分硅藻；②强酸在消化中可能会喷出，同时还会产生污染气体，对人和环境造成损害；③操作繁琐，容易污染，产生假阳性。酶消化法是指使用蛋白酶对组织进行消化。目前常用的蛋白酶有蛋白酶K和胰蛋白酶等。有实验显示蛋白酶K消化后能显示出绝大多数的硅藻，且硅藻结构几乎都被保持。梁新华等[7]发现通过胰蛋白酶消化后，硅藻检出率大于强酸消化法。从现有报道可以看出，蛋白酶消化法对硅藻的检出率优于强酸消化法，且操作简便，更加安全。但蛋白酶消化法也有缺点，如成本相对较高、消化组织时间相对较长。物理消化法主要有高温灰化法和浸渍法。高温灰化法是将组织用特殊的东西加热直至呈灰，然后再用强酸消解后过滤镜检。它的主要优点是操作简单、干扰少。但该方法过程繁琐，灰化过程需要特殊设备，灰化温度和时间较难控制，如操作不当易造成大量硅藻被破坏，检出率低。浸渍法是将组织用蒸馏水浸渍过夜，或用硝酸钠处理后在37℃温箱中浸渍24 h左右，然后取浸渍液离心镜检。此法基本是所有检测方法里最简单易行的，但检出率却不高。每一种消化方式都有各自的优缺点，如果结合各自的特点，将不同类型的消化方式联合起来使用，就可以提高硅藻的检出率。如使用浓硝酸消解检材组织时，同时还在密闭的空间内用微波对组织加热加压，检验效果较好。整个过程有用酸量少，时间短，硅藻种类、数量和完整性均保存较好的特点。强酸消化法除了可以与物理消化法联用，还可以与酶消化法联用。Kakizaki等[8]应用蛋白酶K和盐酸共同消解组织，发现这种方法组织需要量较传统方法少，时间较单纯蛋白酶消化法短，硅藻破坏较少，对环境污染更小。硅藻量化研究需要的消化方式能尽量完整的保存硅藻，这样计算出来的硅藻数量才能更接近实际情况。从现有消化方式来看，酸消化法和物理消化法会对硅藻的破坏或损耗较大，而其他方式相对来说更利于硅藻数量和结构的保存，更适用于硅藻量化的研究。

3.2 几种富集方式的比较

通过各种方式将可能含有硅藻的组织消化后，通常会使用普通离心机离心消化液的方式来使硅藻富集于沉淀中，便于铺片镜检。王会品等[9]研究发现4 000 r/min离心15 min一次硅藻损失在29.94%～49.60%之间，大量的硅藻存在于被弃去的上清液中，而很多消化法为了清洗消化液离心次数往往不止一次，造成硅藻检出率进一步下降。广州市刑事科学技术研究所通过研究发现传统离心方法被弃去的上清中硅藻的最长径＜40 um的硅藻占被弃硅藻的90.00%以上，而进入体循环的硅藻多是小体积硅藻，如进入脑和骨髓中的硅藻大多直径在10 μm以下，因此离心富集硅藻对体内硅藻检验极其不利。王玉仲等人[10]用滤膜孔径为0.45 μm的滤膜对微波消解消化过的硅藻进行富集，然后检验，发现硅藻检出率显著优于传统强酸检测方法。从王玉仲等人使用滤膜的指标来看，我们可以推测这种滤膜富集法可以富集大多数长径在40 μm以下的硅藻，富集率应该优于传统离心方法。

4 影响硅藻量化的因素

影响硅藻量化的因素除了消化、富集的方法以外，主要还有取材及环境因素。目前，硅藻检验取材有相应的标准参考，因此在这里，主要讨论环境因素对硅藻量化检验的影响，它会直接影响到硅藻量化的结果与结果的判定。

4.1 环境因素对硅藻数量与种类的影响

4.1.1 光照 硅藻同一般藻类一样，需要依靠光能进行光合作用产生自身所需的有机物。光线的强度和光周期的变化会直接影响硅藻的生存和生长。一般来说，在其它条件适宜的情况下，适宜的光照强度会使得适合该光照强度的硅藻生长最快。例如尖刺拟菱形藻在光照度在7 000 lx时生长速率达到最大，而东方弯杆藻和月形藻适宜的光照度在500～1 500 lx的范围。有的硅藻适宜的光照强度不是一定的，它会随着温度的变化而变化，如中肋骨条藻，在温度较低时低光照强度繁殖最快，而温度较高时，高光照强度比低光照强度繁殖的速度更快。光周期是指光照与非光照相互相互变化的规律。它会影响细胞内有机物的合成和代谢及细胞分裂模式。

4.1.2 温度 硅藻生长需要一个适宜的温度，在适宜温度范围内硅藻生长速度最快，超过或低于这个温度，硅藻都无法正常生长。绝大多数硅藻适宜温度范围在15～30℃，硅藻水华暴发时水体表面大都在20～30℃间[11]。在适宜温度范围内，温度越高，硅藻生长速率越快。超过一定温度后，硅藻的蛋白质和核酸会受到不可逆的影响，从而生长速率急剧下降。当低于一定温度时，硅藻的新陈代谢会受到抑制，生长速度变慢，但不一定死亡，可能存在“冬眠”状况，等待温度合适继续生长。

4.1.3 水体的流动或搅动 空气中的CO2会随着水体的流动或搅动进入到水体中，为硅藻提供光合作用必需的物质——CO2。一般来讲，水体的流动或搅动越大，二氧化碳含量越多，越有利于硅藻的生长。同时，水体的运动也可带走硅藻的代谢产物，使得硅藻周围的水体维持在一个适宜的水平。另外，水体的流动或搅动可能会把位于水体下层的硅藻移动到中上层中，从而使硅藻多样性指数上升。在泥沙较多的水域，水体的流动或搅动会使泥沙含量升高，水体透明度降低，降低光进入水中的强度，从而影响硅藻的生长。

4.1.4 其他 水中pH值、盐度和污染情况[12]也都会不同程度的影响到不同种类硅藻的生长与繁殖。

4.2 环境因素对硅藻量化影响的对策

由于以上环境变化因素的存在，法医检案提取检材时，如果只提取发现可疑溺水者水域局部范围的水，可能会造成检测出水样中硅藻的种类和数量与溺死者脏器中不一致的情况。建议提取水样前，应综合分析溺死者水域的情况，合理布局，有针对性的提取和分析，这样才能保证判断的准确性。同时，鉴定人员还应该结合尸检的情况，将死后经过时间考虑在内。如果存在季节交替或温度骤变的情况，可能会导致溺死者溺水当时水域与检查时水域中硅藻的种类和数目的差异。

因此要充分考虑以上情况，综合判断，才能在实际检案中得出更加准确的判断，同时才有利于减少硅藻量化过程中的偏差。

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Study on Forensic Medicine of Quantitative Study of Diatom

LIU Quan1,2,KE Ji1,2,WANG Shu-fa1,2
1.Hubei University of Police,Wuhan,Hubei Province,430034 China；2.Hubei Sanzhen judicial expertise center,Wuhan,Hubei Province,430034 China

The quantitative study of diatom contributes to improving the judgment accuracy of drowning before one’s death,and the paper discusses the best test method and procedure of diatom quantitative study by analyzing the common test method,digestive method and advantages and disadvantages of concentration method of some diatoms,at the same time,the paper studies the environment factor issues of influencing the number of diatoms,and puts forwards the corresponding solutions according to these issues and puts forwards their own opinions of optimization of quantitative research test conditions of diatoms.

Diatom;Quantitative;Drowning;Forensic medicine

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.30

2017-01-03；

2017-01-22

湖北省教育厅科学研究计划项目指导项目（项目编号：B2014013）。

刘泉（1982.9-），女，湖北天门人，博士，讲师，研究方向：法医学。