硅藻定量分析在溺死诊断中的应用

杜宇坤，张天叶，刘景建，刘超，康晓东，郑冬云，石河，徐曲毅，马开军，赵建

1.广州市刑事科学技术研究所 法医病理学公安部重点实验室，广东 广州 510442；2.南方医科大学法医学院，广东 广州 510515；3.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海 200083；4.昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500

1904 年，REVENSTORF 首次在溺死者肺内观察到硅藻后，硅藻检验逐渐成为溺死诊断最常用的实验室检查方法[1-5]。过去硅藻检验结果诊断溺死的原则是，肺组织硅藻检验为阳性，肝、肾、牙齿、骨髓等器官中也检出硅藻，且硅藻种类与实地水样一致，即可诊断为溺死[5]。但是，有研究[3-4,6-11]在溺死尸体中未检出硅藻或在非溺死尸体器官组织中检出硅藻，使硅藻检验诊断溺死的价值受到质疑。多年来，研究者不断探索硅藻诊断溺死的标准，提出了建立非溺死尸体各组织器官硅藻的基础数据以甄别溺死或死后入水，但在法医学实践中的应用效果并不理想[3,5,12]。

本课题组前期研究[13-17]发现，通过硅藻定量分析肺组织与水样硅藻含量比值（CL/CD值）能够有效区分溺死与死后入水。因此，本研究拟对490例水中尸体的硅藻检验结果进行回顾性分析，研究溺死及死后入水者肺、肝、肾组织和水样中的硅藻含量及种类，探讨硅藻定量分析在溺死诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 案例情况

收集广州市刑事科学技术研究所与上海市公安局物证鉴定中心于2013 年6 月—2021 年1 月鉴定的490例死因明确的水中尸体案例，尸体均完整。根据490例尸体的死因分为溺死组和死后入水组，其中溺死组468例，死后入水组22例，同时提取尸体处发现的水样（实际取水样案例数为405例，其中溺死组390例，死后入水组15例）。溺死的诊断依据为通过案情调查或有目击者确认溺死，具有溺死的典型病理特征[5]，排除镇静安眠类、有机磷类、毒品及鼠药类等常见毒（药）物中毒。死后入水组案例的死因为颅脑损伤、机械性窒息和电击死。

1.2 硅藻检验

参照《法庭科学硅藻检验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662—2019）[18]对上述尸体的肺、肝和肾组织进行组织样本提取，提取前所有工具、器皿均用超纯水冲洗，确认不含硅藻。采用微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法[19-20]进行硅藻检验。

1.2.1 微波消解

提取肺组织2 g，肝、肾组织各10 g，现场水样30 g于消解管中，加入8 mL 65%浓硝酸（德国Merk 公司）和2 mL 30%过氧化氢（德国Merk 公司）。将消解管置于Multiwave 3000 微波消解仪（奥地利Anton Paar公司）中进行消解。程序设定：将功率在5 min内由0 W升至800 W，保持该功率10 min，然后停止微波消解，通过强风冷却30 min。

1.2.2 真空抽滤

将各组织消解液分别倒入滤杯内使用HL-6 多联真空抽滤仪（珠海黑马医学仪器有限公司）进行抽滤（真空度400 mmHg），加入50 mL 超纯水使滤膜表面接近中性，再加入10 mL 无水乙醇脱去滤膜内水分后取出滤膜。

1.2.3 扫描电子显微镜观察

应用SCD005 离子溅射仪（德国Leica 公司）真空喷镀金膜后将样品座置于Phenom XL G2 台式扫描电子显微镜（荷兰PhenomWorld 公司）下观察。每个样品座都由来自广州市刑事科学技术研究所或上海市公安局物证鉴定中心的2 名具有丰富硅藻检验经验的法医学专家进行检验。计算硅藻含量（个/10 g）=组织检出硅藻数×10/组织质量，记录硅藻种类，计算CL/CD值[14-17]。

1.3 统计分析

使用SPSS 24.0 软件（美国IBM 公司）对数据进行统计学分析。硅藻含量和CL/CD值以均数±标准差（）表示，并依据肺组织对水样中硅藻的富集程度将CL/CD值分为≤1、＞1～＜2 和≥2 3 个范围；依据硅藻含量将水样分为＜100、100～1 000、1 000～10 000、＞10 000 4组。对溺死组和死后入水组各器官与水样中硅藻含量、硅藻种类数、CL/CD值比较，数据符合正态分布和方差齐性使用两样本间t检验，不符合则使用秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 溺死组和死后入水组硅藻检验结果

468例溺死组案例中，肺组织均检出硅藻，阳性率为100.0%；424例肝组织中检出硅藻，阳性率为90.6%；431例肾组织中检出硅藻，阳性率为92.1%。肺、肝和肾组织中同时检出硅藻的共计400例，总阳性率为85.5%。

22例死后入水组案例中，19例肺组织中检出硅藻，阳性率为86.4%；7例肝组织中检出硅藻，阳性率为31.8%；6例肾组织中检出硅藻，阳性率为27.3%。肺、肝和肾组织中同时检出硅藻的共计6例，总阳性率为22.2%。

2.2 各器官和水样中硅藻含量

468例溺死组案例中，肺、肝、肾组织和水样中硅藻含量分别为（113 235.9±317 868.1）、（26.7±75.6）、（23.3±52.2）和（12 113.3±21 760.0）个/10 g。其中76.9%肝组织和74.1%肾组织硅藻含量小于20 个/10 g。肺组织、水样中硅藻含量高于肝、肾组织中硅藻含量（P＜0.05），肝组织和肾组织中硅藻含量差异无统计学意义（P＞0.05）。

死后入水组有18例（81.8%）肺组织硅藻含量低于600 个/10 g，肺组织硅藻含量少于溺死组（P＜0.05）。

2.3 溺死组各器官和水样中硅藻种类

肺、肝、肾组织和水样中硅藻种类数分别为（7.5±2.8）、（2.6±1.9）、（2.9±2.1）和（8.9±3.0）种，其中水样的硅藻种类最多，水样、肺组织中硅藻种类数多于肝组织和肾组织（P＜0.05），肾组织中硅藻种类数多于肝组织（P＜0.05）。肺、肝、肾组织硅藻种类数量与水样相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）

2.4 CL/CD值

390例溺死组和15例死后入水组的平均CL/CD值分别为（100.6±830.7）和（0.3±0.4）。由表1 可见，两组共有128例CL/CD值≤1，31例CL/CD值在＞1～＜2，246例CL/CD值≥2；CL/CD值≥2 的案例全部来自溺死组，死后入水组86.7%（13/15）的CL/CD值≤1。

表1 溺死组和死后入水组CL/CD 值Tab.1 The CL/CD between drowning group and postmortem immersion group

由表2 可见，当水样中硅藻含量增加时，CL/CD值减小；当水样中硅藻含量＜1 000 个/10 g 时，CL/CD值离散趋势较大。

表2 溺死组CL/CD值Tab.2 The CL/CD of drowning group（）

表2 溺死组CL/CD值Tab.2 The CL/CD of drowning group（）

3 讨论

法医学硅藻检验用于诊断溺死一直充满争议，主要在于有时溺死者体内无法检出硅藻，而在非溺死者体内又可以检出硅藻[3-4,6-11]。传统的硅藻检验方法回收率低，难以对各组织器官进行硅藻定量分析[19-20]。而MD-VF-Auto SEM 法最大程度地避免了硅藻富集过程中的损失，显著提高了组织器官的硅藻回收率及硅藻阳性检出率[14,19-20]。本研究中溺死组100.0%案例的肺组织检出硅藻，85.5%案例的肝、肾组织中同时检出硅藻。

在溺死过程中，溺死者在水中有剧烈的主动呼吸，溺液被反复吸入肺组织，该过程可持续6 min左右[5]，因此，溺死尸体肺组织硅藻含量高于水样（P＜0.05）。而肺组织硅藻含量与溺液硅藻含量成正相关，所以CL/CD值可消除溺液硅藻变化的影响[14-17]，更有利于对溺死尸体肺组织硅藻富集程度的分析。本研究结果也显示，溺死组CL/CD值大于死后入水组（P＜0.05）。以上结果说明，在溺水剧烈的呼吸运动过程中，水样中大量的硅藻进入肺中并保留，甚至富集。死后入水组有81.8%（18/22）的案例肺组织硅藻含量低于600个/10 g，低于溺死组（P＜0.05），且死后入水组86.7%（13/15）的CL/CD值≤1，而CL/CD值≥2 的全部为溺死案例。死后入水时，由于缺乏主动呼吸，只有少量的硅藻随水一起被动地进入肺部，肺组织的硅藻含量一般较低。因此，CL/CD值也可能反映溺死者溺死时肺部呼吸活动的强度，CL/CD值越高，越有可能诊断为溺死。但值得注意的是，溺死组部分案例的CL/CD值也＜2，无法单纯依据CL/CD值区别溺死和死后入水。本研究结果显示，水样中硅藻含量越低（＜1 000），CL/CD值的离散趋势越大，此时肺对水中硅藻的富集作用不明显，使CL/CD值不准确[14]。有些案例水样中硅藻含量极少，而肺组织中硅藻含量却很高，可能原因是尸体发现地并非死者的入水地点，所取的水样并非死者吸入的溺液，从而使CL/CD值偏大。

由于水样本身和溺死时间不同，或受尸体腐败、在水中浸泡时间等因素影响，各器官和水样中硅藻含量差异较大，如水井、自来水和高原地区水体中硅藻含量较低，冬季水体中硅藻含量较低[7,14]；随着尸体浸泡时间延长，特别是尸体腐败或水压较高的情况下，硅藻会通过破口进入人体[21]，从而影响各器官和水样中的硅藻含量。而从490例案例总体来看，溺死组肺组织硅藻含量和死后入水组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），因此硅藻肺组织定量分析结果可以作为溺死诊断的证据。溺死过程中，硅藻随溺液被吸入肺部，并由于肺泡-毛细血管屏障作用，绝大部分硅藻被截留在肺组织中，仅有少量硅藻进入体循环，进而到达肝、肾等器官，因此不同组织器官的硅藻含量差异较大[2-5]。本研究结果显示，溺死尸体肝组织和肾组织中硅藻含量差异无统计学意义（P＞0.05），但远小于肺组织和水样中硅藻含量（P＜0.05），且76.9%的肝组织和74.1%的肾组织硅藻含量小于20 个/10 g，该结果可以用来评估硅藻检验结果的有效性，即当发现肝组织或肾组织中的硅藻含量大于肺组织或水样中的硅藻含量时，表明可能存在污染。对溺死组各器官和水样中硅藻种类数的分析发现，水样中硅藻种类最多，肝组织中硅藻种类最少，且都小于水样中硅藻种类数量（P＜0.05）。这是因为溺死时，硅藻随溺液进入肺组织，部分硅藻穿过肺泡-毛细血管屏障进入肺毛细血管，并随血液循环到达肝组织[5,22-23]。内部器官中的硅藻来自溺液，硅藻种类只是水中硅藻群落的一部分，因此器官中的硅藻种类可能比水样中的少。

综上所述，对水中尸体内部器官和水样进行硅藻定量分析可为溺死诊断提供支持性证据，引入CL/CD值这一参数进行分析，能更准确地进行溺死诊断。