复合载药CNTs磷酸钙骨水泥的制备及性能研究①

祝芳芳，张 杰,2，迟艳侠，赵 越，郭晓玲，张向宇

(1.黑龙江省药学研究所，佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007; 2 哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150081; 3佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

复合载药CNTs磷酸钙骨水泥的制备及性能研究①

祝芳芳1，张 杰1,2，迟艳侠3，赵 越1，郭晓玲1，张向宇1

(1.黑龙江省药学研究所，佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007; 2 哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150081; 3佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：制备复合载药CNTs磷酸钙骨水泥，研究其抗压强度、释药性能和体外生物活性。方法：采用化学法制备磷酸钙骨水泥，利用万能试验机测试其载荷强度；采用UV测试磷酸钙骨水泥中庆大霉素释放曲线；利用IR、XRD和SEM研究磷酸钙骨水泥的体外生物活性、化学成分和微观形貌。结果：与磷酸钙骨水泥基体材料相比，复合载药CNTs磷酸钙骨水泥抗压强度提高三倍左右，其中庆大霉素的释放时间增加一倍，体外生物活性提高。结论：CNTs的加入有效提高了磷酸钙骨水泥基体材料的抗压强度、延长了材料中药物释放时间、提高了材料的体外生物活性。

磷酸钙骨水泥；CNTs；庆大霉素；载荷强度

伴随中国社会的不断发展和人民生活水平的提高，国内骨材料的需要持续增长，主要表现为骨折、骨组织坏死、骨癌变等疾病[1，2]。尽管人体骨组织自身具有较强的再生能力，但其自我修复功能只能在小面积、小范围起修复作用，这样一来就带来了对骨修复材料市场的巨大需求。现在临床使用的骨修复材料大致分为：自体骨、异种骨和人工骨移植材料。其中20世纪80年代中期美国发明了一种新型的自固化生物活性骨缺损修复材料-磷酸钙骨水泥(CPC)，是具有代表的人工无机骨移植材料，磷酸钙骨水泥在成分上做到了对天然骨的仿生，所以发现后顿时引起社会的广泛关注[3，4]。碳纳米管(以下简称CNTs)是一种重要的组织工程学材料，力学性能特别优异，有较大的强度和韧性。例如，由一层碳原子的六边形网格卷曲而成的理想的单壁纳米碳管的强度约为钢的100倍，而比重只有钢的1/6。对于CNTs的细胞毒性，虽然仍有争议，但是CNTs对骨细胞是生物相容的、对骨组织没有任何毒性[5，6]。基于此，本文采用化学法先合成磷酸钙骨水泥基体材料，通过在材料中添加CNTs制备复合载药CNTs磷酸钙骨水泥，从而提高磷酸钙骨水泥的力学性能、生物活性和释药性能。

1 材料和试剂

磷酸三钙，浓硝酸，磷酸二氢钙，碳酸钙，柠檬酸，过氧化氢，氯化钠，氯化钾，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，盐酸，均为分析纯；碳纳米管；硫酸庆大霉素注射液；自制圆柱型模具(h=3cm，d=2cm)。

2 实验方法

2.1 磷酸钙骨水泥基体材料的制备

固相配制：将磷酸三钙(TCP)、磷酸二氢钙(MPCP)和碳酸钙(CC)按照1:1:1比例称料，充分混合得到固相材料Ⅰ，共6.00g。液相配制：将柠檬酸与蒸馏水按浓度为5wt%进行配制，得到溶液a；再将磷酸氢二钠与蒸馏水按浓度为12wt%进行配制，得到溶液b；混合溶液a和溶液b得到液相Ⅱ。用调和刀将液相Ⅱ与固相Ⅰ充分混合后，将其注入模具。使用封口膜将模具封口，放置在恒温、干燥处避光保存。

对磷酸钙骨水泥基体材料进行工艺优化，分别考察pH值、液固比和固化时间对抗压强度的影响。其中，pH值:液相Ⅱ的pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、7.0，液固比(mL/g): 液固比为0.3、0.35、0.4、0.45、0.5，固化时间: 2d、8d、16d、30d、60d。

2.2 复合型磷酸钙骨水泥的制备

CNTs羧基化：精确称取50mgCNTs置于100mL烧杯，加入60mL浓硝酸，用封口膜封住，超声30min。加热至100℃，搅拌5h，冷却至室温，再放入75℃烘箱，烘干12h。研磨后密封保存，备用。

CNTs负载庆大霉素：硫酸庆大霉素注射液与CNTs按照30mL:1g比例进行混合，加水稀释至一定体积，在室温下搅拌4h，抽滤干燥(温度80℃)，得到载药CNTs。

复合载药CNTs磷酸钙骨水泥：按照固相Ⅰ质量的0.3%称取载药CNTs，两者均匀混合后放入模具中，保持液固比为0.4mL/g，再加入液相Ⅱ。pH值为4.5，固化时间分别为5d、10d、20d、30d、60d。注入模具，干燥密封保存，得到复合载药CNTs磷酸钙骨水泥。

负载庆大霉素磷酸钙骨水泥：精确量取硫酸庆大霉素注射液的量分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mL；液相Ⅱ的量分别为2.2、2.0、1.6、1.2、0.8和0.4mL。将硫酸庆大霉素注射液与液相Ⅱ混合，再加入到固相Ⅰ中，得到混合料浆，注入模具，干燥密封保存。

2.3 磷酸钙骨水泥体外生物活性

将所制备的磷酸钙骨水泥基体材料和复合载药CNTs磷酸钙骨水泥分别放入盛有250mLPBS的锥形瓶中，浸泡4周。

2.4 磷酸钙骨水泥体外释药实验

将负载庆大霉素磷酸钙骨水泥和复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥浸泡于PBS中，分别在5h、12h、24h、36h、48h时取PBS浸泡液测试吸光度，记为A1i、A2i。得到负载庆大霉素磷酸钙骨水泥和复合载药CNTs磷酸钙骨水泥在PBS中的药物释放曲线。

2.5 磷酸钙骨水泥测试表征

采用XRD射线衍射和红外光谱对磷酸钙骨水泥化学成分进行分析。采用扫描电镜SEM观察磷酸钙骨水泥微观形貌。

3 实验结果与讨论

3.1 不同条件下磷酸钙骨水泥基体材料抗压测试结果

不同pH值条件下所制备的磷酸钙骨水泥载荷强度见图1。

图1 不同pH值条件下磷酸钙骨水泥载荷强度

通过图1分析可知，当pH值﹤4.5时，磷酸钙骨水泥载荷强度随pH值的增大而增大；当pH值>4.5时，载荷强度随pH值增大而减小；当pH值为4.5时载荷强度达到最大，约为1.7MPa左右。不同液固比条件下所制备的的磷酸钙骨水泥载荷强度见图2。

图2 不同液固比条件下磷酸钙骨水泥载荷强度

通过图2分析可知，当液固比<0.4时，磷酸钙骨水泥载荷强度随液固比增大而增大；当液固比>0.4时，载荷强度随液固比增大而减小；当液固比为0.4时载荷强度达到最大，达到2.5Mpa左右。

不同固化时间条件下磷酸钙骨水泥载荷强度见图3。

图3 不同固化时间条件下磷酸钙骨水泥载荷强度

通过图3分析可知，当固化时间<30d时，磷酸钙骨水泥载荷强度随固化时间增大而增加；当固化时间达到30d时，载荷强度达到最大，约3MPa。

由图1、2、3可知，当pH值为4.5、液固比为0.4mL/g、固化时间为30d时，磷酸钙骨水泥载荷强度达到最大，说明抗压性能达到最佳。在该最佳条件下制备复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥，进行以下实验。

3.2 复合载药CNTs磷酸钙骨水泥抗压性能测试结果

复合载药CNTs磷酸钙骨水泥的载荷强度变化曲线见图4。

图4 复合载药CNTs磷酸钙骨水泥载荷强度随固化时间的变化

通过图4分析可知，当固化时间<30d时，复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥的载荷强度随固化时间增加而增加；固化时间达到为30d时，其载荷强度达最大，为10MPa左右。与磷酸钙骨水泥基体材料相比，复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥的载荷强度提高近3倍。所以，CNTs的加入有效提高了磷酸钙骨水泥材料的抗压性能。

3.3 复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥的释药性能

通过图5分析可知，对于负载庆大霉素磷酸钙骨水泥，药物释放速度较快，12h时药物基本释放完全；对于复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥，药物释放速度明显减慢，24h时药物释放浓度达最大。也就是说，与负载庆大霉素磷酸钙骨水泥材料相比，复合载药CNTs磷酸钙骨水泥释药时间延长了1倍，即磷酸钙骨水泥中添加CNTs可有效降低药物释放速度。

图5 负载庆大霉素磷酸钙骨水泥(a)复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥(b)中庆大霉素吸光度随时间的变化曲线

3.4 复合载药CNTs的磷酸钙骨水泥的体外生物活性

载药CNTs磷酸钙骨水泥和磷酸钙基体材料分别在PBS中浸泡4周时的红外光谱见图6。

通过图6可知：载药CNTs磷酸钙骨水泥(b)在513和1053cm-1左右处有PO43-吸收峰， 1535cm-1处出现吸收峰属于CO32-，3489cm-1附近出现宽吸收带属于缔合OH-。与磷酸钙骨水泥基体材料(a)相比，载药CNTs的磷酸钙骨水泥(b)在513、1053、1535和3489cm-1处的峰面积变宽，吸光强度变大，

说明载药CNTs磷酸钙骨水泥中类骨磷灰石的含量高于负载庆大霉素磷酸钙骨水泥，即CNTs的加入提高了磷酸钙骨水泥的生物活性。

图6 磷酸钙骨水泥基体材料(a)载药CNTs磷酸钙骨水泥(b)在PBS中浸泡4周的红外谱图

3.5 复合载药CNTs磷酸钙骨水泥化学成分和表面形貌

载药CNTs磷酸钙骨水泥的表征如图7所示。通过图7(a)可知，载药CNTs的磷酸钙骨水泥材料(a)中主要化学成分为CaHPO4·2H2O，还有少量的Ca10(PO4)6(OH)2。其中，CaHPO4·2H2O的存在有利于诱导新骨的生成。由图7(b)，载药CNTs磷酸钙骨水泥微观形貌呈鳞片状结构。

图7 载药CNTs磷酸钙骨水泥的XRD(a)和SEM(b)

4 结论

本实验采用化学法制备了磷酸钙骨水泥材料，最佳制备条件为在pH值4.5、液固比0.4、固化时间30d；磷酸钙骨水泥中添加CNTs后，其抗压强度提高3倍，药物释放时间延长1倍，体外生物活性提高；载药CNTs磷酸钙骨水泥化学成分为CaHPO4·2H2O和Ca10(PO4)6(OH)2，并且为鳞片状结构。

[1]VenkatasubbuGD,RamasamyS,RamakrishnanV.Hydroxyapatite-alginatenanocompositeasdrugdeliverymatrixforsustainedreleaseofciprofloxacin[J].JBiomedNanotechnol, 2011， 7(6):759-767

[2]洪汉标,陈楷正,陈坚,等.同种异体骨移植的临床应用研究[J]. 中国现代药物应用杂志, 2012, 6(1): 47-48

[3]潘杰, 王勇. 新型人工骨的临床应用[J]. 中外健康文摘, 2012, 9(19): 40-41

[4]钟招明, 韩智敏, 修虎, 等.同种异体骨移植的免疫反应及处理方法[J]. 江西医学院学报, 2003 , 43(6): 146-147

[5]姬海宁,张怀武. 纳米碳管的研究与发展[J]. 磁性材料及器件, 2001, 32(4): 37-40

[6]KimBS,MooneyDJ.Developmentofbiocompatiblesyntheticextracellularatricesfortissueengineering[J].TrendsBiotechnol, 1998, 16(5): 224-230

1.国家自然科学基金青年基金项目，编号：81601616；2.黑龙江省博士后基金项目，编号：LBH-Z15164；3.黑龙江省科学基金项目，编号：H2016086；4.佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：2015xj23。

祝芳芳(1993～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

张杰(1979～)女，黑龙江嫩江人，博士，讲师。E-mail：zjie612@163.com。

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1008-0104(2017)01-0003-03

2016-11-12)