低聚果糖对青春双歧杆菌生物膜形成的影响①

孙亦心，李 蕊，刘铭珠，薛冰冰，刘思聪，王春敏

(1.佳木斯大学临床医学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学基础医学院微生物教研室,黑龙江 佳木斯 154007)

低聚果糖对青春双歧杆菌生物膜形成的影响①

孙亦心1，李 蕊1，刘铭珠1，薛冰冰1，刘思聪1，王春敏2

(1.佳木斯大学临床医学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学基础医学院微生物教研室,黑龙江 佳木斯 154007)

目的:探讨低聚果糖对益生菌制剂来源的青春双歧杆菌生物膜形成的影响。方法：采用微量板法和置片法培养青春双歧杆菌生物膜，应用结晶紫染色法及活菌计数法检测青春双歧杆菌生物膜。结果：低聚果糖可使青春双歧杆菌生物膜形成时间提前24h。结论：应用益生菌制剂联合低聚果糖可提高其生理功能。

青春双歧杆菌；低聚果糖；生物膜

细菌生物膜是指一种或数种细菌生长过程中为适应生存环境，通过分泌胞外多糖和凝胶状黏液，使细菌相互黏连而形成的膜状物。是一种与游离状态细菌相对应的存在形式[1,2]。细菌生物膜广泛存在于含水和潮湿的各种表面上，如牙齿上的菌斑，医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官，据专家估计几乎所有的细菌在一定的条件下都可以形成生物膜[3,4]。致病菌生物膜一旦形成，就具有了极强的耐药性，如在介入性医疗器械使用过程中形成菌膜，一般的抗生素和消毒剂很难穿透生物膜的胞外脂多糖基质层，为医院感染埋下隐患且可成为临床器械相关型感染的来源。因此，目前国内外对生物膜的研究主要集中在致病菌和环境微生物的生物膜形成规律、耐药机制和清除方法。而对益生菌的生物膜研究较少。本文对益生菌制剂来源的青春双歧杆菌的生物膜形成能力及添加低聚果糖对其的影响进行初步探讨。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

青春双歧杆菌来源于市售的益生菌制剂-丽珠肠乐复苏后的纯培养；低聚果糖，市售；TPY液体培养基(广东环凯生物有限公司)；1%的结晶紫溶液；脱脂处理后的灭菌盖玻片；96孔细胞培养板；KQ-100DA型台式超声清洗器(张家港市圣凯电器有限公司)；DNM-9606酶标分析仪(北京普朗)。

1.2 方法

1.2.1 青春双歧杆菌的复苏、鉴定及培养：无菌取丽珠肠乐放入双歧杆菌复苏液中复苏，然后通过革兰染色及生化鉴定，符合青春双歧杆菌后，一部分用TPY液体培养基厌氧培养(A菌液)，一部分在TPY液体培养基中加入0.5%低聚果糖后厌氧培养 (B菌液)。

1.2.2 96孔微量板法培养细菌生物膜及结晶紫染色法检测细菌生物膜：调整A、B菌液的细菌浓度为106cfu/mL后，取200μL上述菌液分别加入96孔板上，每个标本3孔，空白对照孔则加入TPY液体培养基和含有低聚果糖的TPY液体培养基，培养期间每隔24h更换培养液1次，培养结束后倒出培养基，用灭菌蒸馏水清洗小孔，洗去游离细胞，加入200μL1%结晶紫作用30min，用蒸馏水漂洗后加入200μL95%的乙醇，溶解附着于生物膜上的染料，所得有色溶液用酶标仪测定590nm处的OD值(D值)，以未接种的TPY液体培养基和含有低聚果糖的TPY液体培养基分别做空白对照(Dc值)，细菌形成生物膜能力判断方法：无生物膜形成能力D≤Dc；弱生物膜形成能力Dc4Dc。

1.2.3 置片法培养细菌生物膜及超声活菌计数法检测细菌生物膜: 用15mm×15mm的盖玻片，经脱脂处理后再用磷酸盐缓冲液清洗干净，自然晾干灭菌后分别放入无菌培养皿中分别加入25～30mL含有106cfu/mL青春双歧杆菌的A菌液和B菌液 ，在37℃下分别厌氧培养24h、48h、60h及72h后，无菌取出培养的盖玻片放入带盖子的无菌玻璃瓶中，每个玻璃瓶中放入20mL无菌生理盐水，经一定功率超声8min后，取1mL放入无菌平皿内，然后倒入40℃左右的BS培养基15～20mL进行活菌计数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 结晶紫染色法定量分析细菌生物膜形成能力

青春双歧杆菌在A、B两种培养液内分别厌氧培养24h、48h、60h及72h后，A培养液内48h才可见弱的生物膜形成能力，60～72h可见中等生物膜形成能力，且60～72h细菌生物膜形成能力无差异；而在B培养液内24h就可见弱的生物膜形成能力，48～72h均可见中等生物膜形成能力，且48～72h细菌生物膜形成能力无差异。见表1。

2.2 超声活菌计数法检测细菌生物膜内的活菌数

青春双歧杆菌在A、B两种培养液内分别厌氧培养24h、48h、60h及72h后，超声8min后经活菌计数法检测细菌生物膜内的活菌数。见表2。

表1 结晶紫染色法定量分析细菌生物膜形成能力的比较±s)

注：*与A培养液Dc值相比(P<0.05)；#与A培养液24h相比(P<0.05)；△与A培养液48h相比(P>0.05)；☆与B培养液Dc值相比(P<0.05)；○与B培养液24h相比(P<0.05)；※与B培养液48h相比(P>0.05)。

表2 超声活菌计数法检测细菌生物膜内的活菌数±s，cfu/mL)

注：*与A培养液24h相比(P<0.05)；#与A培养液48h相比(P<0.05)；☆与A培养液24h相比(P<0.05)；△与B培养液24h相比(P<0.05)。

3 讨论

青春双歧杆菌为肠道的主要厌氧益生菌，在维持肠道维生态平衡方面起着重要作用。在人体内具有抗肠道细菌感染、抗衰老、抗肿瘤和提高肠黏膜免疫等多方面的生理功能[5～7]。而发挥上述功能的最基础机制就是菌群屏障的作用。因此，益生菌制剂在预防和辅助治疗腹泻、炎症性肠病等疾病中发挥了重要作用。另外，各种低聚糖类的益生元制剂由于可以特异促进益生菌生长，并较益生菌容易储存等优点也已被广泛应用。

生物膜是众多细菌适应外界环境的一种群体生活方式。由于生物膜复杂的结构特点，使其较单一个体更能适应其所生存的环境。有研究表明某些双歧杆菌在生长繁殖过程中可形成生物膜 。且不同来源的双歧杆菌形成生物膜的能力不同并易受培养基成分等因素的影响[8,9]。因此，本实验对临床常用的益生菌制剂-丽珠肠乐来源的青春双歧杆菌形成生物膜的能力进行初步探讨，发现青春双歧杆菌在TPY培养液中48h才开始有弱的生物膜形成能力，而在含低聚果糖的TPY培养液中24h就开始有弱的生物膜形成能力，说明低聚果糖可以特异增加双歧杆菌数量的同时还可以促进双歧杆菌生物膜的形成。但该双歧杆菌与大多数致病菌12h就可形成生物膜的报道不相符且无论培养液内是否添加低聚果糖，该益生菌来源的青春双歧杆菌均未检测到强的生物膜形成能力。其原因除与不同菌种遗传因素及自身生理特点有关外，还与生活环境中氧含量有关。

双歧杆菌等益生菌是肠道的优势菌群，大量双歧杆菌吸附于肠黏膜表面形成生物膜，并通过与其它厌氧菌共生形成菌群屏障，通过营养占位、分泌有机酸及过氧化氢、刺激肠黏膜免疫细胞增生和增加SIgA数量等作用抑制致病菌的黏附、生长，维护肠道健康。其种类和数量越多说明肠道微生态环境越好，肠道微生态处于平衡状态，肠道功能越健康。因此，与致病菌形成生物膜意义不同的是益生菌在消化道形成生物膜对机体是有益的，是益生菌发挥菌群屏障和免疫屏障的基础。本实验的青春双歧杆菌来源于临床常用的益生菌制剂，说明该益生菌不但通过增加益生菌的数量发挥调节肠道微生态平衡的作用，而且还可能通过自身形成生物膜或与其他益生菌共生形成生物膜来发挥菌群屏障作用，但从该菌在实验中形成生物膜的时间来看，提示我们临床应用含双歧杆菌的益生菌制剂时，最好联合应用低聚果糖类的益生元，尽快使服用的益生菌在肠黏膜形成生物膜，使菌群屏障和免疫屏障的作用充分得以发挥。

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黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：2014xj09。

孙亦心(1994～)女,黑龙江密山人，在读本科学生。

王春敏(1966～)女,黑龙江密山人，硕士，教授,硕士研究生导师。E-mail:wangchunmin66@126.com。

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1008-0104(2017)01-0042-02

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