粪便钙卫蛋白及血清自身抗体联合检测对炎症性肠病的诊断价值*

刘国瑞，马巧蓉，李玲慧，郑田，严孝岭，李毅，虞伟

(1.南京军区南京总医院 a.解放军临床检验医学研究所，b.解放军普通外科研究所，南京 210002；2.广西医科大学附属民族医院检验科，南宁 530001)

粪便钙卫蛋白及血清自身抗体联合检测对炎症性肠病的诊断价值*

刘国瑞1a，马巧蓉2，李玲慧1a，郑田1a，严孝岭1a，李毅1b，虞伟1a

(1.南京军区南京总医院 a.解放军临床检验医学研究所，b.解放军普通外科研究所，南京 210002；2.广西医科大学附属民族医院检验科，南宁 530001)

目的 探讨联合检测血清抗胰腺外分泌腺抗体(PAB)、抗酿酒酵母抗体(ASCA)、抗杯状细胞抗体(GAB)、抗中性粒细胞胞浆抗体(PANCA)及粪便钙卫蛋白(FC)在炎症性肠病(IBD)诊断和鉴别诊断中的价值。方法 收集确诊的克罗恩病(CD)患者107例及溃疡性结肠炎(UC)患者98例作为IBD组，非IBD肠病疾病患者79例作为疾病对照组，用间接免疫荧光法检测血清PANCA、ASCA、GAB和PAB，用双抗体夹心ELISA法检测FC浓度。对3组血清PANCA、GAB、PAB、ASCA及FC检测的数据进行对比分析。结果 205例IBD患者血清PANCA、GAB、PAB、ASCA的阳性率分别为36.1%、29.8%、38.0%、4.9%；IBD组、CD组与UC组FC浓度均高于疾病对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，CD组与UC组间比较无统计学意义(P>0.05)。PANCA在CD和UC组的阳性率分别为8.4%、66.3%；PAB在CD和UC组的阳性率分别为65.4%、8.2%；PAB、PANCA、GAB、ASCA、FC及5项联合在鉴别诊断IBD与非IBD肠道疾病中的敏感性和特异性分别为38.0%、36.1%、29.8%、4.9%、54.1%、63.4%和98.7%、96.2%、94.9%、100%、68.4%、93.7%。5项联合鉴别诊断IBD与非IBD肠道疾病的ROC曲线下面积为0.819；PANCA用于UC鉴别诊断的ROC曲线下面积为0.816；PAB用于CD鉴别诊断的ROC曲线下面积为0.823。结论 GAB为一种IBD相关自身抗体，可用于IBD的辅助诊断；PAB和PANCA分别为CD和UC重要的血清学标记物，对该类疾病诊断具有高度敏感性和特异性；将FC与自身抗体联合对于IBD与非IBD胃肠道疾病的鉴别具有重要意义，但对于区分CD或UC价值不大。

炎症性肠病；克罗恩病；溃疡性结肠炎；抗体；钙卫蛋白

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种发病机制不明的肠道非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)和克罗恩病(Crohn′s disease， CD)。临床上鉴别诊断UC和CD主要依赖于临床和病理学检查，而且还需排除传染性疾病和其他类似疾病，有很大局限性。因此，临床需要方便准确、非侵入性、廉价的检测指标及方法实现IBD的鉴别诊断、评估分期和疗效判定。核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(PANCA)、抗杯状细胞抗体(GAB)、抗胰腺外分泌腺抗体(PAB)和抗酿酒酵母抗体(ASCA)是比较有代表性的相关自身抗体[1-3]，在IBD的诊断和鉴别诊断、活动度分期等方面有不同的作用。粪便钙卫蛋白(fecal calprotectin，FC)能够很好地反映肠道炎症严重程度且检测方便，取材容易[4]。本文联合检测上述标志物，探讨其对IBD诊断和鉴别诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2016年6月解放军南京军区南京总医院住院患者，均经临床表现、影像学检查、消化道内镜及病理学检查，符合“2012年IBD诊断与治疗的共识意见”拟定的诊断标准[5]。CD组107例，其中男68例，女39例，年龄(33.1±12.9)岁；UC组98例，其中男58例，女40例，年龄(42.1±15.4)岁；同期其他肠病对照组79例(包括小肠溃疡31例，小肠炎症23例，小肠息肉13例，肠结核8例，其他胃肠炎4例)，其中男47例，女32例，年龄(42.8±17.1)岁。3组研究对象年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 标本采集

1.2.1 血液样本 抽取空腹静脉血2～3 mL，3 500 r/min离心10 min分离血清，置-40 ℃冻存待检。

1.2.2 粪便样本 在肠镜检查口服清肠药前3 d内留取受检者粪便10～20 g，置-40 ℃冻存待检。

1.3 血清PANCA、ASCA、GAB和PAB抗体检测 采用间接免疫荧光法，生物马赛克物薄片购自德国欧蒙公司。所有操作严格按试剂说明书要求进行。PANCA、GAB 和PAB抗体检测样本采用欧蒙PBS稀释液1∶10稀释，ASCA抗体检测样本做1∶1 000稀释，荧光显微镜下观察结果。以标准滴度荧光强度为参照，报告4项自身抗体的血清滴度(此即为半定量结果)。根据试剂盒说明书推荐的阳性判断标准，确定PANCA、GAB和PAB滴度cut-off 值为10，ASCA滴度cut-off 值为1 000，以上视为阳性。

1.4 FC检测 采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒购自瑞士Bühlmann公司。所有操作严格按试剂说明书要求进行。用IMARK酶联仪(Bio-Rad公司)读取450 nm波长处吸光度(A)。绘制标准品浓度对相应A值的标准曲线，计算样本浓度(μg/g)。

1.5 结果赋值与参数指标值的归一化 由于FC为定量结果，血清自身抗体为半定量结果，在绘制ROC曲线时，须先将FC及自身抗体进行量化赋值并归一化。根据血清自身抗体滴度量化并分为9个等级(ASCA荧光强度值为100倍结果)，见表1。FC检测结果按试剂说明书标准，以>50 μg/g表示阳性，以实际检测结果/50进行量化分级。量化值统一是按照单项量化值(x)/单项值总和(sum)取对数[公式为lg(x/sum×106)]。

表1 血清PANCA、ASCA、GAB 和PAB 自身抗体结果赋值表

1.6 统计学分析 用SPSS 19.0软件进行。由于FC为非正态分布，故采用中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。血清自身抗体阳性率比较采用卡方检验，用配对四格表分别计算检测项目用于鉴别诊断CD、UC、IBD的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。绘制ROC曲线，以约登指数(敏感性+特异性-1)最大时的检测值确定为诊断的最佳截断点。以P<0.05为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 FC及4种自身抗体检测结果 IBD组、CD与UC组FC浓度均高于疾病对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，CD与UC组间比较无统计学意义(P>0.05)。PAB在CD组中阳性率为65.4%，高于UC组(8.2%)和对照组(1.3%)，差异均有统计学意义(P<0.05)；PANCA在UC组中的阳性率为66.3%，高于CD组(8.4%)和疾病对照组(3.8%)，差异均有统计学意义(P<0.05)；GAB在CD、UC和疾病对照组阳性率分别为30.0%、29.6%和5.1%，CD和UC组间差异无统计学意义(P>0.05)，但两组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；ASCA在CD、UC和疾病对照组阳性率分别为4.8%、5.1%和0，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组FC浓度和PAB、GAB、PANCA、ASCA阳性率

注：与疾病对照组比较，#，P<0.01；a，P<0.05；与UC组比较，b，P<0.05。自身抗体阳性判断依据：为试剂盒说明书提供的cut-off值。

2.2 FC、自身抗体单项和联合检测用于IBD鉴别诊断的效果评价 根据ROC曲线，FC单独应用于鉴别诊断IBD与非IBD肠道疾病的cut-off值为294.3 μg/g，此时敏感性和特异性分别为54.1%和68.4%。血清PAB、PANCA、GAB、ASCA抗体用于鉴别诊断IBD与非IBD肠道疾病的敏感性和特异性分别为38.0%、36.1%、29.8%、4.9%和98.7%、96.2%、94.9%、100%。联合FC与血清自身抗体诊断IBD的敏感性可提高至63.4%，特异性为93.7%，阴性预测值49.7%，阳性预测值96.3%，见表3。ASCA、PANCA、PAB、GAB、FC及联合5项指标对IBD鉴别诊断ROC曲线下面积分别0.518、0.663、0.685、0.623、0.663和0.819，见图1。

表3 FC、PAB、PANCA、GAB、ASCA及5项联合鉴别诊断IBD的效能

项目敏感性(%)特异性(%)阴性预测值(%)阳性预测值(%)FC*54.168.437.581.6PAB38.098.738.098.7PANCA36.196.236.796.1GAB29.894.934.293.8ASCA4.9100.028.8100.05项联合63.493.749.796.3

注：*，cut-off值为294.3 μg/g。

2.3 自身抗体检测及与FC联合检测用于UC、CD鉴别诊断的效果评价 PAB用于CD鉴别诊断的敏感性为65.4%，特异性98.7%，曲线下面积为0.823，5项联合对CD鉴别诊断敏感性为67.3%，特异性为89.97%，曲线下面积为0.810；PANCA用于UC鉴别诊断的敏感性为66.3%，特异性为96.2%，曲线下面积为0.816，5项联合对UC鉴别诊断的敏感性为67.3%，特异性为93.7%，曲线下面积为0.828。

图1 FC、4种抗体单独及联合检测用于IBD鉴别诊断的ROC曲线分析

3 讨论

FC是由Fagerhol等[6]首先从中性粒细胞中分离出来的钙锌结合蛋白，存在于中性粒细胞和巨噬细胞中，大约占中性粒细胞蛋白质成分的60%[7]。研究表明，FC有抗菌、免疫调节、抗增殖活性，在炎症活动的调节中起着重要作用[8-9]。FC可以抵抗酶的分解，在室温下可以稳定7 d，不受饮食的影响，很容易在粪便中检测到[10]。

本研究对205例确诊IBD患者及79例非IBD疾病患者血清PANCA、PAB、GAB、ASCA抗体水平及FC进行检测，发现PAB在CD中的阳性率为65.4%，其鉴别诊断CD及其他肠道疾病的ROC曲线下面积为0.823，在敏感性为65.4%时，特异性达到98.7%，可用于与UC的鉴别诊断。Joossen等[11]也提出PAB的存在即是CD的标志。GAB在IBD中的阳性率为29.8%，显著高于对照组的5.1%，其在CD与UC中的阳性率差异无统计学意义，可以认为GAB是一种与IBD相关的自身抗体，可作为IBD的辅助诊断，但不适用于鉴别UC与CD。PANCA在UC中的阳性率为66.3%，其鉴别诊断UC及其他肠道疾病的ROC曲线下面积为0.816，在敏感性为66.3%时，特异性达到96.2%。研究表明，PANCA主要存在于UC患者，文献报道UC患者PANCA的阳性率为43.4%～70%[12]，与本研究一致。可认为PANCA作为UC的血清标志物，可用于UC与其他肠道疾病的鉴别诊断。FC用于鉴别诊断IBD及其他肠道疾病ROC曲线下面积仅为0.663，将FC与几种自身抗体联合应用对CD诊断的价值与单独PAB检测相比，敏感性由65.4%提高为67.3%，但特异性却从98.7%下降至89.97%；因此，5项指标联合检测对鉴别CD或UC诊断的价值提升不大。但FC与血清IBD相关抗体联合应用，对于鉴别IBD与非IBD胃肠道疾病的敏感性可提升至63.4%，特异性仍可保持在93.7%，具有重要价值。

本研究未纳入健康人群，也未对不同IBD分期结果进行比较。实际上，联合检测对鉴别IBD与非IBD胃肠道疾病的特异性将会更高。另据文献报道，FC有利于对疾病进行动态监测，且FC检测方便，可以准确地判断疾病活动度[13-14]。

根据本研究结果，ASCA在IBD中的阳性率为4.9%，低于国内外文献报道水平[1,15]，ASCA对IBD的鉴别诊断未见特别价值。分析以上出现差异可能原因为：(1)种族遗传差异，欧美患者与亚洲人群遗传背景的不同可能造成彼此血清自身抗体的显著差异，此可能为主要原因；(2)实验室和实验技术手段不同；(3)ASCA检测试剂盒说明书推荐的cut-off值(1∶1 000)为来自于欧洲人群的参考值，是否适合于中国人群值得思考。另外，本研究检测的是ASCA-IgG，较ASCA-IgA来说，IgG的阳性率相对更低，联合检测IgG和IgA可能会提高诊断敏感性。由于ASCA 在不同研究机构获得的数据有所不同，故其临床价值有待于进一步研究证实。

综上所述，4种抗体对于IBD诊断的敏感性都不高，不适用对IBD患者进行筛查。GAB是与IBD相关的一种自身抗体，可作为IBD的辅助诊断，但不适用于CD与UC的鉴别诊断； PAB可作为CD的血清标志物，PANCA可作为UC的血清标志物，可分别用于CD和UC的鉴别诊断。将FC与上述4种自身抗体联合对于IBD与非IBD胃肠道疾病的鉴别诊断具有重要价值，但对于鉴别诊断CD或UC疾病的价值提升意义不大。

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(本文编辑：刘群)

Diagnostic value of combined detection of fecal calprotectin and serum autoantibodies in inflammatory bowel diseases

LIUGuo-rui1a,MAQiao-rong2,LILing-hui1a,ZHENGTian1a,YANXiao-ling1a,LIYi1b,YUWei1a

(1.a.InstituteofClinicalLaboratoryMedicineofPLA,b.InstituteofGeneralSurgeryofPLA,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangxiMinzuHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity,Nanning530001,Guangxi,China)

Objective To investigate the values of combined detection of serum pancreas autoantibodies(PAB), anti-saccharomyces cerevisiae antibodies(ASCA), goblet cell autoantibodies(GAB) and antineutrophil cytoplasmic antibodies(PANCA) and fecal calprotectin(FC) in the diagnosis and differential diagnosis of inflammatory bowel diseases(IBD). Methods The serum and feces samples from IBD patients, including 107 with definite Crohn′s disease(CD) and 98 with definite ulcerative colitis(UC), and 79 non-IBD patients as the control were collected. Serum PANCA, ASCA, GAB and PAB were detected by an indirect immunofluorescence assay, and FC concentration by double-antibody sandwich ELISA. The results from different patients were compared and analyzed. Results The positive rates of serum PANCA, GAB, PAB and ASCA in 205 IBD patients were 36.1%, 29.8%, 38.0% and 4.9%, respectively. The FC concentrations in IBD, CD and UC patients were significantly higher than that in the control(P<0.01), while there was no statistical difference between CD and UC patients(P>0.05). The positive rates of PANCA in CD and UC patients were 8.4% and 66.3%, respectively, while those of PAB in CD and UC patients were 65.4% and 8.2%, respectively. The sensitivity and specificity of PAB, PANCA, GAB, ASCA, FC and their combination in the differential diagnosis of IBD and non-IBD were 38.0%, 36.1%, 29.8%, 4.9%, 54.1%, 63.4% and 98.7%, 96.2%, 94.9%, 100%, 68.4%, 93.7%, respectively. The area under the ROC of the combination of 5 markers was 0.819 in differentially diagnosing IBD and non-IBD. The area under the ROC of PANCA for the differential diagnosis of UC was 0.816, while that of PAB for the differential diagnosis of CD was 0.823. Conclusion GAB is an autoantibody associated with IBD, which may be helpful for the auxiliary diagnosis of IBD. PAB and PANCA are the important serological markers for the diagnosis of CD and UC, respectively. The combination of FC with PAB, PANCA, GAB and ASCA may be used for the differential diagnosis of IBD and non-IBD, but has little value in distinguishing CD and UC.

inflammatory bowel disease; Crohn′s disease; ulcerative colitis; antibody; calprotectin

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.06

国家自然科学基金(81670471)。

刘国瑞，1979年生，男，主管技师，主要从事临床免疫学实验室诊断工作。

虞伟，教授，硕士研究生导师，E-mail:yuwei211@126.com。

2016-11-10)