附子对高糖刺激下施万细胞中Krox20-Oct6信号通路及其调控的髓鞘蛋白的影响

吕甜甜 王宏亮 邢玮 吴晏 王伟 张子剑 韩静

·论著·

附子对高糖刺激下施万细胞中Krox20-Oct6信号通路及其调控的髓鞘蛋白的影响

吕甜甜 王宏亮 邢玮 吴晏 王伟 张子剑 韩静

目的 观察附子对高糖培养下施万细胞中Krox20-Oct6途径及其调控的髓鞘蛋白的影响，以揭示附子治疗糖尿病周围神经病变的机制。方法 将施万细胞分为以下6组：(1)正常组(低浓度葡萄糖)；(2)对照组(甘露醇)；(3)模型组(高浓度葡萄糖)；(4)附子水提物高、中、低剂量组(10 μg/mL,1.0 μg/mL,0.1 μg/mL)。常规培养3天后，采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA的表达水平，采用Western blot法检测各组细胞的Oct6和Krox20蛋白的表达水平，采用免疫荧光法检测各组细胞的髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z蛋白的表达水平。结果 PCR结果显示，与正常组相比，模型组中Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表达水平下降；与模型组比，附子水提物各剂量组中Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表达水平上升。Western blot结果证明，与正常组相比，模型组中Oct6蛋白、Krox20蛋白表达水平下降；与模型组比，附子水提物各剂量组中Oct6蛋白、Krox20蛋白表达水平上升。免疫荧光结果提示，与正常组相比，模型组中髓鞘碱性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表达水平下降；与模型组比，附子水提物各剂量组中髓鞘碱性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表达水平上升。结论 高浓度葡萄糖通过抑制Krox20-Oct6途径使施万细胞髓鞘蛋白生成能力下降，而附子可能通过Krox20-Oct6途径促进髓鞘蛋白的形成，从而改善糖尿病周围神经病变。

糖尿病周围神经病变； 附子； 施万细胞； Krox20-Oct6信号通路

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病常见的并发症[1]，常见症状有神经传导速度减慢和温度感觉异常，病理特征主要为神经轴突萎缩以及髓鞘的受损[2-3]。DPN的作用机制尚未明确，临床药物应用具有其自身的局限性，因此亟需探索新的作用机制以及新的药物治疗方法。

附子为毛茛科多年生草本植物乌头的子根加工品，味辛、甘、大热，有毒，具有回阳救逆、散寒止痛等功效[4-5]。本课题组前期研究表明附子可以改善糖尿病大鼠神经传导障碍，缩短糖尿病大鼠的热板潜伏期[6]，提示附子可能对DPN具有治疗作用，但是其作用机理尚未得以揭示。施万细胞是髓鞘形成的一部分，在髓鞘受损时，施万细胞进行分化，参与髓鞘的再生[7]。生理状态下，Krox20-Oct6信号通路在髓鞘形成过程是核心环节，调节髓鞘蛋白的生成[8]。本实验拟观察在高糖培养下施万细胞中Krox20-Oct6信号通路及其调控的髓鞘蛋白的变化，探讨附子对Krox20-Oct6信号通路的影响，从而为深入阐述附子的药理作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药物及主要试剂

附子饮片(四川江油,编号20110728)；DMEM培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；0.05%胰蛋白酶(Solarbio公司)；一抗和HRP标记的山羊抗兔IgG均购买于abcam公司；DAPI(Sigma公司)；FITC标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.2 细胞株

RSC96细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.3 主要仪器

CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；核酸蛋白检测仪(美国Quawell公司)；蛋白垂直电泳和转膜系统、凝胶图像分析系统、PCR仪、荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)；激光共聚焦扫描显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。

1.4 附子单味药水提物的制备

采用道地产地四川江油附子饮片，取适量置于提取容器中，加入10倍量水，回流提取，过滤，药渣加8倍量水，回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，得到附子水提取物。

1.5 细胞培养和分组

采用贴壁细胞培养的方法，培养基为含有10%的胎牛血清的DMEM完全培养基(内含1%的青霉素和链霉素)，培养环境为5%的CO2，37℃，饱和湿度，2～3天换液一次。

实验分组：(1)正常组：DMEM基础培养基；(2)对照组：DMEM基础培养基+50 mm甘露醇；(3)模型组：DMEM基础培养基+50 mm葡萄糖；(4)附子高剂量组：10 μg/mL附子DMEM基础培养基+50 mm葡萄糖；(5)附子中剂量组：1 μg/mL附子DMEM基础培养基+50 mm葡萄糖；(6)附子低剂量组：0.1 μg/mL附子DMEM基础培养基+50 mm葡萄糖。1.6 实时定量PCR法检测Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、髓鞘蛋白Z(myelin protein zero, MPZ)的表达水平

常规方法提取RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，使用Nanodrop 2000测量RNA浓度，然后反转录合成cDNA。依据NCBI GenBank中提供的Oct6、Krox20、MBP和MPZ的mRNA序列，引物序列见表1。按以下反应体系：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 5μL；DEPC水3.4μL；上游引物0.3μL，下游引物0.3μL；cDNA 1μL。PCR扩增反应条件：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 15秒；60℃ 60秒(40个循环)。以β-actin作为内参，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。

表1 引物序列

1.7 Western blot检测Oct6及Krox20蛋白的表达

细胞加入RIPA裂解液，充分裂解后，离心取上清液，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜，TBST(含5%脱脂奶粉)室温封闭2小时，TBST漂洗3次，加入一抗4℃孵育过夜；然后TBST漂洗，再加入二抗，室温2小时；采用ECL试剂盒检测。使用Image Lab软件分析条带灰度，采用目的蛋白/β-actin的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.8 免疫荧光检测MBP及MPZ蛋白表达

制备细胞爬片，4%的多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100打孔，加入正常血清封闭，滴加适当稀释的抗体，置湿盒中4℃过夜，滴加荧光二抗(1∶50稀释)，37℃孵育30分钟，加入DAPI染核5分钟，蒸馏水终止反应，甘油封片。使用激光共聚焦显微镜FV1000观察细胞，DAPI的激发波长为405 nm，发射波长488 nm；FITC的激发波长488 nm，发射波长519 nm。采用Image J软件分析荧光强度，以其他各组相对于正常组荧光强度的倍数表示MBP或MPZ的蛋白表达水平。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 附子对MBP及MPZ基因及蛋白水平的影响

PCR结果显示，与正常组比较，模型组MBP基因的含量降低(P<0.05)；同时，与模型组比较，附子高剂量组MBP基因含量增加(P<0.01)，附子低剂量组MBP基因含量增加(P<0.05)；另外，模型组的MPZ基因含量较正常组降低(P=0.051)，但差异无统计学意义，附子不同剂量组MPZ基因含量较模型组升高(P<0.01)。见表2。

表2 附子对MBP及MPZ基因表达水平的影响

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01。

免疫荧光结果显示，与正常组比较，模型组MBP的蛋白水平表达降低(P<0.01)，模型组MPZ的蛋白水平表达降低(P<0.05)；同时，与模型组比较，附子不同剂量组MBP的蛋白水平表达升高(P<0.01)；与模型组比较，附子高剂量MPZ的蛋白水平表达升高(P<0.05)，附子低剂量组MPZ的蛋白水平表达升高(P<0.01)。见图1、2及表3。

2.2 附子对Krox20及Oct6基因及蛋白水平的影响

PCR结果显示，与正常组比较，模型组Krox20及Oct6的基因的含量降低(P<0.01)；与模型组比较，附子不同剂量组Krox20及Oct6基因的含量增加(P<0.01)。见表4。

图1 附子对MBP蛋白表达水平的影响(免疫荧光，×600)

图2 附子对MPZ蛋白表达水平的影响(免疫荧光，×600)

表3 附子对MBP及MPZ蛋白表达水平的影响

注： 与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，

dP<0.01。

Western blot结果显示，与正常组比较，模型组Krox20及Oct6的蛋白表达水平降低(P<0.01)；与模型组比较，附子高剂量及低剂量组Krox20的蛋白表达水平升高(P<0.01)，附子不同剂量组Oct6蛋白水平表达均升高(P<0.01)。见图3及表5。

表4 附子对Krox20及Oct6基因表达水平的影响

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

注：A.正常组B.对照组C. 模型组D.附子高剂量组E.附子中剂组F.附子低剂量组

表5 附子对Krox20及Oct6蛋白表达水平的影响

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

3 讨论

髓鞘是包围在轴突的膜层结构，主要由施万细胞组成。它可以保护轴突并促进受损的轴突再生。糖尿病可以引起髓鞘再生受损，进一步会发生糖尿病周围神经病变。

生理状态下，Krox20-Oct6信号通路是髓鞘形成的关键步骤，是施万细胞髓鞘化的必要转录因子[9]。Oct6促进施万细胞从前髓鞘化状态向髓鞘化转变，Oct6作为转录因子可以调控施万细胞中髓鞘表型相关标记物如MBP、P0和MPZ的表达[10]。在Oct6敲除小鼠中，坐骨神经髓鞘化程度显著受损，MBP、P0和MPZ水平降低[11]。Krox20促进髓鞘化的完成，在髓鞘形成的过程中持续表达，参与髓鞘蛋白MBP、P0和MPZ的转录。在Krox20敲除小鼠中，坐骨神经可见脱髓鞘现象，MBP、P0和MPZ水平降低[12]。Oct6和Krox20在髓鞘形成的过程中作用明显不同[13]，但是又相互依赖，共同调节髓鞘的形成。

本研究发现高浓度葡萄糖可造成施万细胞中Oct6、Krox20、MBP、MPZ蛋白表达下调，而附子则可以上调Oct6、Krox20、MBP、MPZ蛋白表达，且Oct6、Krox20、MBP、MPZ的基因表达水平与蛋白的表达趋势一致。结合本课题组前期研究结果，可以推测葡萄糖浓度升高时，Krox20-Oct6信号通路被抑制，施万细胞中髓鞘蛋白的合成减少，从而使髓鞘受到损伤，导致神经传导障碍或温度感觉异常。而附子则能通过Krox20-Oct6信号通路促进髓鞘组成成分基因及蛋白的表达，使髓鞘功能得以改善，从而使神经传导与温度感知功能得以恢复。

本研究不仅从髓鞘形成的角度探讨了DPN的发病机制，为DPN的治疗提供了潜在的药物靶点，而且揭示了附子治疗DPN的分子机制，为后期附子活性物质的研究奠定了基础。

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(本文编辑： 禹佳)

Aconiti lateralis radix praeparata on the formation of myelin sheath and the Krox20-Oct6 signaling pathway in Schwann cells induced by high glucose

LVTiantian，WANGHongliang，XINGWei，etal.BasicMedicalCollegeofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

Correspondingauthor:HANJing,E-mail:hanjing8585@163.com

Objective To investigate the Krox20-Oct6 signaling pathway in Schwann cells induced by high glucose and to analyze the effect of aconiti lateralis radix praeparata on the formation of myelin sheath, and then clarify the mechanisms underlying the therapeutic effect of aconiti lateralis radix praeparata in diabetic peripheral neuropathy. Methods Schwann cell were divided into six groups. In the control group, the cells were supplemented with normal cell culture medium. In the mannitol group, the cells were fed with normal glucose plus mannitol. In the model group, the cells were supplemented with high glucose medium. In the other group, the cells were treated with high glucose medium plus different concentrations of aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL). After three days, Real-time PCR was used to detect the expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero mRNA. Western blot was used to detect Oct6 and Krox20 protein expression. Myelin basic protein and myelin protein zero protein expression was detected by immunofluorescence. Results PCR results showed that compared with the control group, the model group showed lower expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero protein. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero protein. Western blot results indicated that compared with the control group, the model group showed lower expression of Oct6 and Krox20. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata(0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of Oct6 and Krox20. Immunofluorescence results showed that compared with the control group, the model group showed lower expression of myelin basic protein and myelin protein zero protein. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of myelin basic protein and myelin protein zero protein. Conclusion These results indicates that high glucose can decrease the protein of myelin sheath by inhibiting Krox20-Oct6 pathway and that aconiti lateralis radix praeparata improves the diabetic peripheral neuropathy via enhancing the formation of myelin sheath.

Diabetic peripheral neuropathy(DPN); Aconiti lateralis radix praeparata; Schwann cells; Krox20-Oct6 signaling pathway

国家自然科学基金(30901959)；北京中医药大学自主课题(0100604165)

100029 北京中医药大学基础医学院[吕甜甜(硕士研究生)、王宏亮、邢玮、吴晏、王伟、张子剑、韩静]

吕甜甜(1989- )，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：糖尿病周围神经及视网膜并发症。E-mail：lvtiantian471398@163.com

韩静(1977- )，女，博士，副研究员。研究方向：糖尿病周围神经及视网膜并发症。E-mail：hanjing8585@163.com

R932

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.003

2016-03-21)