橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中TLR-4和NF-κB表达的影响研究

陈明喆 何伟

·论著·

橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中TLR-4和NF-κB表达的影响研究

陈明喆 何伟

目的 研究橙皮苷对IgA 肾病大鼠肾脏组织中TLR-4和NF-κB表达的影响，探讨橙皮苷对肾脏是否有保护作用及其作用机理。方法 雄性SD大鼠60只随机分为正常组、模型组和橙皮苷治疗组，IgA模型建立成功后，橙皮苷治疗组给予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃治疗，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，治疗4周后、8周后分别处死大鼠，检测其24小时尿蛋白、血尿素氮、血白蛋白、白介素-1(interleukin-1，IL-1)和白介素-6 (IL-6)，免疫组化、RT-PCR以及Western blot检测肾组织中TLR-4和NF-κB表达。结果 在整个实验过程中，正常组饮食正常，精神良好，模型组和橙皮苷治疗组在造模成功后表现有一定的食欲不振和精神萎靡，使用橙皮苷治疗后，上述情况有所缓解；与正常组相比，模型组24小时尿蛋白、血尿素氮、IL-1和IL-6明显升高(P<0.05)，白蛋白明显下降(P<0.05)，治疗4周后，上述指标有明显改善，治疗8周后其基本和治疗4周后一致；RT-PCR、Western blot和免疫组化可见，相较于正常组，模型组TLR-4和NF-κB蛋白及mRNA表达明显增加(P<0.05)，橙皮苷治疗4周后，其有明显降低，治疗8周后，表达更弱(P<0.05)。结论 橙皮苷可明显下调TLR-4和NF-κB的表达，进而降低炎症反应，改善肾功能，最终保护肾脏组织。

橙皮苷； IgA肾病； Toll样受体4； 自然细胞杀伤因子-κB

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是临床中最为常见的一种肾小球原发性疾病，本病多见于青少年儿童，其临床主要表现为反复发作的血尿以及不同程度的蛋白尿[1]。由于本病多和自身免疫力相关，所以在发病前长伴有一定的上呼吸道病史，此外本病预后良好，但是在临床中仍有25%到30%的患者预后不理想，进而发展为终末期肾病[2]。对于本病的治疗西药多以激素治疗为主，而中草药在治疗此病时具有很好疗效，但是中草药在向国际推广时，面临着药物成分复杂，药理作用不明确的尴尬境地，所以采用现代化思维来研究中药是具有实践意义的[3]。橙皮苷是从橙皮中提取的一类苷类化合物，本次研究用橙皮苷治疗IgA肾病大鼠，观察治疗后其肾脏组织中TLR-4和NF-κB的表达特点，以明确橙皮苷是否可以缓解IgA肾病大鼠症状以及其治疗机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本次实验共购买SD大鼠60只，所有大鼠均购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，大鼠体质量为180～200 g，所有大鼠购买后均给予定时定量饮水，同时勤换垫料的基础上适应性喂养2周，2周后开始构建IgA肾病模型。

1.1.2 主要试剂和材料 本次药物橙皮苷购于湖北合天化工有限公司；造模用试剂牛血清蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)以及四氯化碳(CCl4)购于中国国药公司；造模用花生油购于山东鲁花有限公司；造模用蓖麻油购于上海化学有限公司；TLR-4抗体，NF-κβ抗体购于英国abcam公司，总RNA提取试剂盒购于天根生物公司，引物合成由南京金斯瑞生物工程公司完成。

1.2 动物模型的建立以及分组

所有大鼠在造模前均给予一次检测血液肾功能，肾功能没有异常后开始分组和造模，60只大鼠采用随机原则分为正常对照组、模型对照组(IgA肾病组)，以及橙皮苷治疗组，每组为20只，模型对照组和橙皮苷治疗组在分组后即给予造模，造模按照经典方法进行[4]，首先每天给予1次牛血清蛋白灌胃，灌胃量为400 mg/(kg·d)，共灌胃10周；大鼠每周注射一次0.5 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周；分别于第6周后、第8周后给予大鼠脂多糖0.05 mg尾静脉注射；为使实验准确，在造模时正常对照组每天给予等量的生理盐水灌胃，注射也为等量生理盐水，10周后，观察其造模成功，造模成功的判断标准为：可见明显血尿以及镜下检测可发现有30%的红细胞。

1.3 大鼠治疗方法

大鼠在造模成功后开始治疗，橙皮苷治疗组给予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃治疗(10 mg橙皮苷溶于1 mL的生理盐水中)，正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃，分别于治疗4周后、8周后处死大鼠，进行下述实验。

1.4 组织提取方法

大鼠处死时采用3%的戊巴比妥麻醉，麻醉后沿腹中线切开大鼠腹部，首先从心尖处取血，取血后立即离心，离心速度为4000 rpm，离心后提取上清液置于超低温冰箱保存备用检测(-86℃)，之后迅速取出肾脏，统一取左侧肾脏切取十分之一置于10%的中性福尔马林溶液中保存，其余置于超低温冰箱保存备用(-86℃)。

1.5 生化指标检测

大鼠生化指标的检测采用全自动生化仪完成，检测指标为24小时尿蛋白定量、血尿素氮以及白蛋白，炎性因子白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)和IL-6的检测采用Elisa试剂盒，试剂盒购于武汉bio-sweap公司，检测方法为双抗体夹心法。

1.6 免疫组化

本次检测用免疫组化法检测大鼠肾脏组织中TLR-4和NF-κB的表达具体方法如下：(1)首先将多聚甲醛固定好的肾脏组织取出，酒精梯度脱水后将其置于融化的石蜡组织中进行包埋，包埋后进行切片，切片厚度为3～5 μm，之后将切片置于60℃恒温箱中烘烤20分钟；(2)烘烤后将组织进行脱蜡、之后用PBS洗涤3次，每次5分钟；(3)上述完成后采用3%的双氧水浸泡，浸泡后洗涤，洗涤完成后修复抗原，之后加入相应一抗、二抗后，DAB显色，显色后脱水、透明、封片，显微镜下观察染色程度以及蛋白的表达位置。

1.7 肾组织TLR-4和NF-κB mRNA的检测

肾组织TLR-4和NF-κB mRNA的检测采用半定量RT-PCR法，具体为称取30 mg肾脏组织，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取后定量调平，之后行逆转率以及扩增反应，引物设计为TLR-4，上游：5′-GGCGAGCGTCATGTACACACAAC-3′，下游：5′TGGAAAGCCGACGCAGACGCTGC-3′，产物长度为296 bp；NF-κB上游：5′CTCGAAATACTCACAAGGTCCCGGCGAT-3′，下游：5′ AC GGTACAACGAGTAAAGAAGAC-3′，产物长度为296 bp；内参为β-actin，其中上游为：5′CAGGCGTAAGCTCCGCCACTTCCGTAT-3′，下游为：5′GGCCGGCACCAAGCTTCTTCGGTAC，产物长度为521 bp。反应条件为94℃预变性2分钟，之后同样温度变性30秒，48.6℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后再延伸5分钟。完成后每组各取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后采用凝胶成像仪照片，并分析电泳带灰度值，全组以β-actin为内参，每组实验重复3次。

1.8 TLR-4和NF-κB蛋白表达的检测

肾组织TLR-4和NF-κB蛋白质的表达检测采用Western blot法，首先用总蛋白提取试剂盒提取肾脏组织中总蛋白，之后总蛋白用BCA法定量，定量后立即给予调平，再测定一次后进行下述实验，首先设置好实验分组，之后每组各取50 μg进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后切取目标蛋白，之后将其立即转移到PVDF膜上(美国Santa公司)，转移后用脱脂牛奶封闭2小时洗涤3次后加入一抗，洗涤3次，之后加入二抗洗涤3次，洗涤完成后进行ECL荧光照片，全组实验以β-actin作为内参，凝胶成像仪分析系统扫描并定量胶片条带灰度值，每组实验重复3次。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

在分组前所有大鼠饮食均正常，同时皮毛光滑有明显的光泽，而造模成功后，模型组和橙皮苷治疗组大鼠活动明显减少，同时精神萎靡，毛色发黄，橙皮苷开始治疗后，皮毛等明显有好转，饮食和饮水也有明显改善，精神活动虽有一定改善，但不明显。

2.2 肾功能相关指标

由表1可见，模型组与对照组相比，血尿素氮和24小时尿蛋白明显升高(P<0.05)；白蛋白明显降低，橙皮苷治疗4周，血尿素氮和24小时尿蛋白均明显降低(P<0.05)，白蛋白明显升高，治疗8周后，上述指标进一步改善(P<0.05)。

表1 治疗4周后和8周后大鼠肾功能基本指标评价

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.3 血清IL-1和IL-6的测定

与正常组比较，模型组大鼠IL-1和IL-6明显升高(P<0.05)。橙皮苷治疗4周后，其水平较模型组均明显下降(P<0.05)，治疗8周后进一步降低。详见表2。

表2 治疗4周后和8周后大鼠血清中IL-1以及IL-6含量变化

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.4 免疫组化

免疫组化可见，正常对照组只有少量的NF-κB和TLR-4分泌(图中褐色部分所见)，模型组NF-κB和TLR-4明显增高，橙皮苷治疗后上述两个指标分泌均明显下降，治疗8周后下降更明显，详见图1和图2。

图1 大鼠肾脏组织中NF-κB免疫组化图

图2 大鼠肾脏组织中TLR-4免疫组化图

2.5 蛋白表达

与正常组相比，模型对照组NF-κB和TLR-4蛋白表达均明显升高(P<0.05)，治疗4周后NF-κB和TLR-4明显降低(P<0.05)，治疗8周后基本和治疗4周后一致，详见图3和表3。

2.6 mRNA表达

与正常组相比，模型对照组NF-κB和TLR-4的mRNA表达均明显升高(P<0.05)，治疗4周后NF-κB和TLR-4明显降低(P<0.05)，治疗8周后基本和治疗4周后一致，详见图4和表4。

图3 治疗4周后和8周后大鼠肾脏组织中NF-κB和TLR-4的蛋白表达

表3 治疗4周后和8周后大鼠肾脏组织中NF-κB和TLR-4的蛋白的相对表达量

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

图4 治疗4周后和8周后大鼠肾脏组织中NF-κB和TLR-4的mRNA表达

表4 治疗4周后和8周后大鼠肾脏组织中NF-κB和TLR-4的mRNA的相对表达量

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

3 讨论

IgA肾病简而言之就是一种以血清中IgA明显升高，造成其在肾脏中过度聚集，进而引发病变的一种病症[5]。目前已有大量的研究显示[6-8]，IgA肾病与遗传和基因表达异常密切相关，是典型的免疫系统疾病。单纯的降低免疫反应危害较大，非急性患者使用会带来很多不良反应，而目前西药治疗本病没有特效药，因此积极研究和开发治疗本病的药物是十分必要的。已有的研究表明，IgA免疫球蛋白的异常增高可以造成其在肾脏的沉积，而沉积最主要的危害就是引起肾脏炎症反应，这种炎症反应必须积极消除，否则会反作用于已经受损的肾脏，造成其后续并发终末期肾炎、肾脏衰竭等[9]。因此治疗本病的原则除降低免疫反应外，依靠药物降低免疫炎症介质，使其不易在肾脏中沉积是治疗本病的一个方向。

橙皮是经典中药材之一，其价格便宜但效果较好，临床中多用其配合其他中药材合用，具有化痰理气、健脾导滞等疾病，此外其还可以用于治疗感冒咳嗽，食欲不振，胸腹胀痛以及肠鸣便泻等[10-11]，橙皮苷是从橙皮中提取的一类化合物，研究显示橙皮苷具有维持患者渗透压、增强患者毛细血管的韧性、降低胆固醇等方面作用，而近年来关于其可以调节肾功能，改善一些肾病也有文献报道[12]，但是目前关于其是否可以治疗IgA肾病还没有文献报道，本次采用经典造模法构建IgA肾病模型，该造模方法虽然造模时间长，但其主要作用为破坏大鼠免疫能力，因此将其用于IgA肾病发生后的研究是有意义的，研究显示，与正常组相比，模型组24小时尿蛋白、血肌酐、白介素1和白介素6明显升高(P<0.05)，白蛋白明显下降(P<0.05)，治疗4周后24小时尿蛋白、血肌酐、白介素1和白介素6明显降低，白蛋白明显升高，而治疗8周后，上述指标基本与治疗4周后一致，这提示橙皮苷对IgA肾病大鼠短期内具有一定的调节作用，但是远期效应一般。

白介素1和白介素6的降低表明其对炎症反应具有很好的调节作用，但具体是哪种酶的调节还需明确，由于炎症反应首先发生于IgA免疫蛋白集结于肾病后，因此降低炎症反应说明其可以缓解IgA肾病的进展，临床中TLRs是既参与免疫反应又参与炎症反应的重要因子，本因子可在肝脏、肾脏、脾以及肺中广泛表达，进而介导炎症反应，其靶向介导炎性因子较多，其中激活转录因子NF-κB是最为直接的一环，NF-κB是炎症反应最典型介质之一，其可以杀伤坏死的细胞，但是在杀伤的同时也会激活大量炎症因子，诸如IL-1和IL-6，最终影响免疫和炎症反应[13-16]。本次研究采用免疫组化、Western blot以及RT-PCR重点观察其治疗后NF-κB和TLR-4表达明显降低，这提示橙皮苷对IgA肾病具有很好的调节作用。

综合提示：橙皮苷可明显下调IgA肾病大鼠肾脏组织中TLR-4和NF-κB的表达，进而降低炎症反应，改善肾功能，最终保护肾脏，但其调控炎症反应远期效应较差，具体原因仍有待于后期研究进行。

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(本文编辑： 董历华)

Effect of hesperidin on TLR-4 and NF-κB in kidney tissue of IgA nephropathy rats

CHENMingzhe，HEWei.TheNephrologyDepartmentofHuangshiCentralHospital，Huangshi435000，China

Correspondingauthor：HEWei，E-mail：hsyiyuantougao@163.com

Objective To study the effect of hesperidin on TLR-4 and NF-kB in IgA nephropathy rats，and discuss whether hesperidin have the protective effect to kidney and its protection mechanism. Methods 60 male SD rats were randomly divided into normal group，model group and hesperidin treatment group，after the IgA model was successfully established，hesperidin treatment group was given hesperidin (10 mg/kg·d) to lavage treatment，the normal group and model group was given equal saline lavage，and after 4 weeks and 8 weeks of treatment, rats were sacrificed to detect the 24h urine protein，serum BUN，blood albumin，interleukin 1 and interleukin-6，immunohistochemistry，RT-PCR and Western Blot was used to detect the expression of TLR-4 and NF-κB in renal tissue. Results In the process of the whole experiment，the normal group was fed with normal diet and the spirit was good，model group and the hesperidin group has certain anorexia and depression after molding， the above situation was improved after using hesperidin; Compared with normal group，model group in 24h urinary protein，serum BUN，interleukin-6 and interleukin-1 rise obviously，albumin was significantly lower，after 4 weeks of treatment，those indices were improved significantly，results of 8 weeks and 4 weeks of treatment were basically the same; Compared with normal group，TLR-4 and NF-kB protein and mRNA expression in model group were significant increased，after 4 weeks of treatment of hesperidin, these indices were significantly reduced，after 8 weeks of treatment，the expression was more less (P<0.05). Conclusion Hesperidin can obviously decrease the expression of TLR-4 and NF-kB and inflammatory reaction，it also can improve renal function，eventually to protect kidney.

Hesperidin； IgA nephropathy； Toll-like receptor 4； NF-κB

435000 黄石中心医院自筹项目(2014HS023)

鄂东医疗集团黄石市中心医院肾内科(陈明喆)，老年病科(何伟)；湖北理工学院医学院(何伟)

陈明喆(1981- )，硕士，主治医师。研究方向：中西医结合治疗老年病。E-mail：12616918@qq.com

何伟(1980- )，硕士，主治医师，讲师。研究方向：中西医结合治疗肾病。E-mail：hsyiyuantougao@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.002

2016-07-09)