脱落细胞DNA的提取和检验2例

张辉，高林林，王波

（1.舟山市公安局刑事科学技术研究所，浙江舟山 316021；2.杭州市公安局刑事科学技术研究所，浙江杭州 310004）

脱落细胞DNA的提取和检验2例

张辉1，高林林2，王波1

（1.舟山市公安局刑事科学技术研究所，浙江舟山 316021；2.杭州市公安局刑事科学技术研究所，浙江杭州 310004）

法医遗传学；基因分型技术；QIAcube纯化法；脱落细胞

1 案例

1.1 简要案情

案例1：某市发生一起入室盗窃案件，现场勘验确定为1人作案，案犯攀爬跳窗进入室内，其跳落的地面存在明显脚印，脚印附近散落了少量白色粉尘状颗粒，提取该检材进行DNA检验。

案例2：某机关办公室发生一起保险箱被撬案件，结合视频确定为1人作案。提取保险箱所在地附近的粉尘状检材进行DNA检验。

1.2 提取和检验过程

上述两案例均使用脱落细胞提取仪（公安部物证鉴定中心）收集生物检材，吸头在选定的范围内滑动吸取脱落细胞约20s。案例1中吸取的范围是鞋印周围5 cm的地面面积，案例2中吸取的范围是以撬锁位置为中心、半径为20 cm的地面面积。吸取后把滤膜的第二、三层分别放入2.0mL套管（德国QIAGEN公司）中，用QIAamp®DNA Investigator试剂盒（德国QIAGEN公司）提取，每管加入裂解缓冲液ATL 300 μL，蛋白酶K 20 μL，保证检材完全浸没，充分振荡混匀，56℃保温1 h，期间振荡1次，以离心半径6 cm，13 000 r/min，离心5 min，取出套管得到备检液体。将液体放入QIAcube全自动核酸提取仪（德国QIAGEN公司），洗脱体积设置为20 μL，操作步骤参考仪器说明书。模板DNA使用Identifiler®Plus试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），在9700型PCR扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行PCR扩增。反应体系20μL，模板DNA 8μL，29个循环，操作按试剂盒和仪器说明书进行。扩增产物在3500xl基因分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行毛细管电泳。

1.3 检验结果

两起案例的第二层滤膜均得到了15个STR基因座的分型结果，其中10个基因座检见3个等位基因峰，主次峰的面积比值大于4∶1，第三层滤膜获得的图谱中单个基因座检见1或2个等位基因峰，峰高差小于20%，部分基因座缺失。联合两层滤膜的图谱结果进行分析，推断出嫌疑人可能的STR基因型（表1），输入全国公安机关DNA数据库，均比中了犯罪前科人员，经侦查符合案情。

表1 两起案例的STR分型结果

2 讨论

在作案过程中，嫌疑人可能在现场留下痕迹，如何从中获取有效的信息是勘验工作的重点。检验微量DNA的关键在于能否收集到足够的DNA和消除影响PCR的抑制剂[1]，科学的提取方法与合适的检验策略尤为重要。

负压吸附法通常用于质软、粗糙、易渗透载体上DNA的提取，本文两案例的客体较光滑，但需要提取的面积很大，考虑其表面较洁净，尝试用负压吸附法能集中靶细胞并减少载体体积，有利于后续检验。

QIAcube全自动核酸提取仪配合QIAamp®DNA Investigator试剂盒使用，特制的硅胶膜既能与DNA特异性结合，又能滤去大颗粒杂质与可溶性PCR抑制物，用小体积ATE缓冲液洗脱，可以得到不含蛋白质、核酸酶和抑制剂的DNA浓缩液，有利于下游的PCR扩增[2]。

根据滤膜的结构，第一层能够去除大部分杂质，第三层相对干净，但细胞数经过层层过滤已大大减少，第二层提取到的DNA最接近需求。为了客观统计，我们核查第二、三层的图谱，第三层谱图出现双峰时峰面积相近，可视作单人图谱或者2个均为单STR峰的人混合，结合现场已知人员分型和单人作案的条件，能够排除混合。第二层图谱的部分基因座为混合型，其主次峰面积比值大于4∶1，根据苑美青等[3]总结的方法拆分混合样本，可以推断出最具价值的STR分型。

本文两起案例能够成功检验，笔者总结出几点经验，供同行参考：（1）针对原始现场尚未遭到破坏，客体表面洁净的载体适用于此法。（2）要准确判断提取范围，盲目扩大吸取的范围不但不能增加靶细胞的数量反而容易增加外源性污染和抑制物。（3）使用离心套管过滤杂质，减少换管对DNA的损耗。（4）采用硅胶膜法提取纯化，适当增加ATL裂解液，有利于充分裂解细胞；缩小洗脱体积，有利于浓缩模板DNA。（5）选用抗抑制能力强的扩增试剂盒，采用大体系平行扩增，可保证图谱的均衡性；适当增加扩增循环数和模板浓度，可提高检测灵敏度。（6）联合分析两层滤膜的分型，结合现场实际情况，根据平行扩增的结果进行分型，尽量避免等位基因的误判。

[1]Gill P，Whitaker J，Flaxman C，et al.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA[J].Forensic Sci Int，2000，112（1）：17-40.

[2]廖长青，成静，刘维.Chelex-100法和QIAcube纯化法在接触性检材检验中的比较[J].法医学杂志，2015，31（2）：148-149.

[3]苑美青，李万水，康艳荣，等.混合样本拆分查询犯罪嫌疑人的应用研究[J].刑事技术，2012，（6）：5-7，12.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.033

1004-5619（2017）01-0106-02

2015-10-19）

（本文编辑：李莉）

张辉（1978—），女，主检法医师，主要从事法医物证DNA检验及研究应用；E-mail：zscoco2002@163.com