不同高度钝力打击致大鼠皮肤与骨骼肌挫伤的对比

百茹峰，吕小娇，鄂晓霏，于天水，刘冉，张海东

（1.2011司法文明协同创新中心，北京 100088；2.中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京 100088）

·论著·

不同高度钝力打击致大鼠皮肤与骨骼肌挫伤的对比

百茹峰1，2，吕小娇1，2，鄂晓霏1，2，于天水1，2，刘冉1，2，张海东1，2

（1.2011司法文明协同创新中心，北京 100088；2.中国政法大学证据科学教育部重点实验室，北京 100088）

目的探讨不同高度钝力打击下，皮肤与骨骼肌挫伤后的修复过程差异。方法采用自主设计的自由落体打击装置，以打击高度为主要损伤程度考量因素，将自由落体从15、30、50cm高度打击造成SD大鼠下肢三种不同程度的挫伤。采用组织形态学方法观察损伤后6h、24h、3d、7d、13d皮肤及肌肉的修复过程。结果三个打击高度引起实验大鼠下肢挫伤，基本都可形成皮下组织和（或）肌肉内的出血，在伤后24h内修复的过程基本类似，但表现程度随打击高度增加而明显；15cm挫伤组在3d时出血区红细胞已基本融解消散，而30cm挫伤组则延迟至7d；伤后13d时，15cm和30cm挫伤组表现基本类似，但50cm挫伤组则仍处于增生旺盛期。结论随着打击高度的增加，皮肤及肌肉同时出血的比例明显增加，挫伤后组织修复的炎症反应、增生反应表现逐渐加重，修复的过程也出现相应的延长。综合法医学实践应用以及本研究结果，推荐以50cm高度所致挫伤（2.58J/cm2）作为今后挫伤损伤时间研究的实验动物参考模型。

法医病理学；皮肤；挫伤；肌，骨骼；大鼠；损伤时间

在机械性损伤的法医学鉴定中，尤其是对于在一定时间段内受到多次损伤的案例，损伤时间的判定是需要重点关注的内容。在日常法医学实践检案中，挫伤是一种常见的损伤类型，其损伤时间的准确推断也是法医病理学研究热点之一。在既往研究中，建立动物挫伤实验模型的方法并不完全一致，如止血钳钳夹法、不同高度自由落体打击等[1-3]，并且未能对使用不同方法所致挫伤的损伤情况、挫伤后的组织修复基本过程如炎症阶段、增生阶段等进行详细报道，使得应用这些实验模型得到的实验结果缺乏可比性；同时，在法医学实践中，亦需要针对不同程度挫伤情况采用相应的损伤时间推断数学模型。鉴于此，本研究采用自由落体打击方法，对比不同打击力量对大鼠下肢形成挫伤的损伤程度、损伤的可重复性、挫伤后的修复过程，试图为今后挫伤的损伤时间研究探索重复性好、容易控制实施的大鼠挫伤实验模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年健康Sprague-Dawley雄性大鼠61只，体质量350～420g（北京维通利华实验动物技术有限公司），随机分为15 cm、30 cm、50 cm挫伤组，每个挫伤组按伤后6h、24h、3d、7d、13d时间段进行观察。每个挫伤组每个观察时间点大鼠4只及正常对照组1只。

1.2 打击装置的构成

本研究中的简易打击装置主要由3部分构成：固定架、滑道管、打击锤。滑道管为一50cm不锈钢管，两端铁片焊接密闭，并在密闭铁片中心钻孔，孔的大小可容下打击锤两端柱形钢，打击锤上下两端各焊接一柱形钢，总质量为500 g，放置于滑道管内，可在上下方向自由滑动。通过调整、固定滑道管和打击锤的位置，使得打击锤能够按固定高度垂直击打，打击锤末端柱形钢作为与动物相接触的结构，表面为平面作为打击面。

1.3 主要试剂

CD3兔抗大鼠多克隆抗体（标记T淋巴细胞）、CD20小鼠抗大鼠单克隆抗体（标记B淋巴细胞）、CD68小鼠抗大鼠单克隆抗体（标记单核巨噬细胞）、alpha-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）小鼠抗大鼠单克隆抗体（标记肌成纤维细胞）、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG，以上抗体均购自苏州睿瀛生物技术有限公司；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）兔抗大鼠单克隆抗体（标记中性粒细胞，英国abcam公司）；过氧化物酶封闭液、羊血清封闭液（进口，北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色浓缩试剂盒（北京Solarbio科技有限公司）。

1.4 动物模型制备

动物采用速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣达动物药品有限公司）按0.1mL/kg在左后肢进行肌肉注射麻醉，右后肢剪毛备皮。将大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，于右小腿内侧面（距跟骨2.5 cm），分别用自由落体打击器从15、30、50cm高度打击致伤。按自由落体势能计算公式（Ep=mgh）计算打击势能，本研究中3个挫伤组打击的势能分别为0.74 J、1.47 J、2.45 J。其中，15cm打击锤末端的直径为0.8cm（1.46J/cm2），30 cm、50 cm打击时为了防止皮肤被撕裂，将打击锤末端直径增加至1.1cm（1.55J/cm2、2.58J/cm2）。

1.5 取材方法

挫伤后不予任何处理，大鼠分笼饲养于自由获得饲料与水的洁净环境中，待至预定观察时间点后颈椎脱臼法处死，并立即取右后肢打击区域皮肤与肌肉（腓肠肌），标本大小为1.0cm×0.6cm×0.3cm，在生理盐水中简易清洗表面血液后，用4%多聚甲醛溶液固定。正常对照组动物备皮后直接取材。

1.6 切片染色与观察

HE染色：4μm切片脱蜡至水，苏木素染色10min，1%盐酸-乙醇分化，60℃温水返蓝，1%伊红染色40s，自来水水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

免疫组织化学染色：4μm切片脱蜡至水，将切片浸泡在柠檬酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH=6.0）中，95℃或沸水中加热10 min进行抗原热修复；3%过氧化氢溶液20 min，PBS水洗，山羊血清封闭，室温孵育10 min；直接滴加适当比例一抗（CD3/CD20/CD68：1∶ 200；MPO：1∶ 40；ɑ-SMA：1∶1 200），4℃冰箱过夜；滴加过氧化物酶标记二抗30min；DAB显色；染核、脱水、透明、封片。

观察：在CX22型光学显微镜（日本Olympus公司）下由3名高级职称法医病理学专家分别进行观察记录。

2 结果

2.1 皮肤及骨骼肌挫伤后的肉眼观察

所有实验大鼠均能保持皮肤完整，未出现撕裂创，三组不同高度打击挫伤大鼠基本都可形成皮下和（或）肌肉组织的出血，具体见表1。50cm高度打击时出现1例骨折，余实验动物均未发生骨折。大鼠右后肢被击打后均出现不同程度肿胀，呈暗红色，取材时可见皮肤、肌肉明显水肿，3d后肿胀基本消退，7d后挫伤区皮肤类似于正常对照组动物皮肤，在50cm挫伤组中仍可见肌肉内灶性出血。

表1 3个挫伤组中皮下和肌肉组织伤后出血例数[n（%）]

2.2 免疫组织化学和HE染色形态观察

无论是皮肤挫伤区还是肌肉挫伤区，随着损伤时间延长均可分为炎症、增生、瘢痕形成3个阶段，即便在无明显出血的样本中，仍可看到有不同程度的修复过程，如炎症反应等。

随着打击高度的增加，挫伤的程度明显增强，主要表现在皮下组织与肌肉区挫伤后无出血的例数下降，以及皮下组织与肌肉区同时出血例数增加，并且出血的范围亦明显扩大，修复时间也随着损伤程度的加重而延长（表2、图1～2）。

表2 不同打击高度损伤在观察时间段的组织形态学表现

图1 免疫组织化学染色结果（×100，标尺长度：100μm）

图2 50cm挫伤组修复过程（HE×100，标尺长度：100μm）

3 讨论

动物实验的主要局限性是难以找到与人体对外界刺激反应完全相类似的实验动物，尽管如此，动物模型对认识人类损伤、疾病的原因及病理生理过程仍起到至关重要的作用，并且已成为证实药物治疗作用的有效工具。大鼠与人类在很多器官系统如皮肤等，都具有相似的病理生理特征，大鼠皮肤由表皮和真皮层所构成，损伤后的修复过程同人体大体类似，也要经历炎症、增生、瘢痕三个过程。其与人体的主要区别是大鼠属于“松散皮肤化动物（loose skinned animal）”，皮肤具有较大弹性并缺乏与皮下组织的牢固结合，创口修复的主要方式是皮肤收缩，而不是人体的皮肤再生修复[4]。大鼠作为皮肤实验的优点是其强大的免疫抵抗能力，与大型实验动物（如猪）相比，大鼠在实验过程中不易受到外源性细菌感染而发生败血症，亦不出现免疫抑制，其损伤后修复时间缩短以利于研究者快速认识整个创伤修复过程。因此，利用大鼠进行皮肤损伤修复研究，具有经济、高效的特征[4]。基于此，大鼠被广泛选用为多种皮肤损伤后的修复研究，如药物在全层皮肤切除模型的治疗作用[5]、放射性损伤模型[6]、皮肤切割伤模型[7]、皮肤烧伤模型[8]等。

损伤时间推断研究是法医病理学的一个长期关注热点，研究对象主要是皮肤[2，3，9，10]、骨骼肌[11，12]等，既往多集中于皮肤切创的损伤时间研究[13，14]。但本实验室的前期研究[13，15]结果证实，在皮肤切创和挫伤中，检测的3个炎症因子（IL-1beta、COX-2和MCP-1 mRNAs）出现不同的表达方式，说明不同类型的损伤可能存在不同的修复过程，这就意味着需要针对不同类型损伤研究相应的损伤时间推断方法[13，15]。近年来，损伤时间的研究开始关注挫伤类损伤[2，3，11，16]，并开展了相应的动物模型研究[17]，但对皮肤挫伤的动物实验模型研究则较少。因此，本研究通过对大鼠下肢不同打击高度所致挫伤的组织病理学变化进行系统观察，以说明不同挫伤程度的组织修复过程。

在此次研究中，随着挫伤程度增加，组织学表现逐渐加重，修复的过程也出现相应的延长。其中50cm挫伤组与彭雪等[3]研究中采用的打击高度（54 cm）类似，在观察的时间段中，24 h内主要以中性粒细胞炎症反应为主，而至3d以后肌纤维细胞增生为主要表现，7d之后主要表现为肉芽组织增生，炎症细胞反应明显减少，但仍可见B、C淋巴细胞，单核巨噬细胞与中性粒细胞，而这些炎症细胞浸润的表现与15、30cm挫伤组的表现明显不同。此外，50cm挫伤组中肌肉的组织病理学表现与于天水等[17]建立的重度肌肉挫伤模型相类似，但该研究未对损伤后炎症细胞进行分类，且观察时间最长至伤后第7天。损伤后3d内主要以肌肉细胞坏死和炎症细胞浸润为主，3 d后则出现分化再生的肌细胞，后者所用的打击动能为2.25J，与本次研究中50cm挫伤组的势能2.45J较接近。在运动医学研究中，常用的SD大鼠骨骼肌钝挫伤实验模型来自于Kami等的实验[18]，采用的是自由落体打击方法，打击锤质量为350g，高度为45.7cm，打击动能为1.57J，在刘树坤等[19]的实验中，对此类大鼠肌肉钝挫伤实验模型进行组织病理学观察，发现在挫伤后3 d内大量炎症细胞浸润，5d时明显下降，并开始出现少量瘢痕组织，7d后炎症细胞基本消失，直到14d后仍有瘢痕组织增生趋势，但在该研究中未能对炎症细胞进行种类鉴别。

另一方面，在本研究中，30cm、50cm挫伤组在增加打击高度的同时，亦增加了打击面积，通过计算单位面积释放能量，30 cm挫伤组（1.55 J/cm2）与15 cm挫伤组（1.46J/cm2）接近，但通过观察两组损伤后的出血情况及修复过程中的组织学表现，30cm挫伤组较15cm挫伤组仍然为重，这说明挫伤的严重程度不仅与单位面积释放能量有关，同时与受力面积成正相关，由此建议在今后的损伤模型实验中，不仅应报道打击能量或高度，亦应同时报道打击锤面积的相关数据。

在法医学实践中，需要推断损伤时间的案例往往经历了严重的损伤，甚至最终死亡；另一方面，本研究结果证明不同程度挫伤的修复过程具有差异性，并且在15cm打击高度时，挫伤后出血情况具有不确定性，可出现在皮下组织和（或）肌肉组织，甚至表现为无出血，而在50 cm打击高度时，挫伤后出血在皮下和肌肉组织中的占比为87.5%，表明50cm高度打击所致损伤具有较好的可重复性。因此，综合考虑这些因素，笔者认为在开展挫伤损伤时间推断研究工作中，以50cm打击高度（2.58J/cm2）建立实验动物下肢挫伤模型不仅能够更客观模拟现实中需要推断损伤时间的情况，而且具有较好的实验重复性。但还需要引起重视的是，在本研究50 cm挫伤组中，发生1例骨折情况，意味着随着打击高度或者势能的进一步增加，骨折的发生率会有相应增加，而骨折无疑是在挫伤动物模型基础上另一新类型损伤的叠加，骨折因素在挫伤实验中的影响程度可能是进一步研究的内容，并且亦是今后挫伤研究者需要认真考虑的因素之一。

（本研究由中国政法大学青年创新团队项目资助）

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Comparison of the Skin and Skeletal Muscle Contusion in Rats Induced by Blunt Force with Different Heights

BAI Ru-feng1,2,LÜ Xiao-jiao1,2,E Xiao-fei1,2,YU Tian-shui1,2,LIU Ran1,2,ZHANG Hai-dong1,2
（1.2011 Cooperative Innovation Center of Judicial Civilization,Beijing 100088,China;2.Key Laboratory of Evidence Science,China University of Political Science and Law,Ministry of Education,Beijing 100088,China）

ObjectiveTo explore the differences in the repair process of skin and skeletal muscle after contusion caused by blunt force attack with different heights.MethodsThree degrees of contusion were performed on SD rats’right hind limbs by a designed free-dropping device falling from 15,30 and 50cm heights,which as a main consideration factor for degree of injury.The repair process of skin and skeletal muscle at 6 h,24 h,3 d,7 d and 13 d after contusion were observed using routine histological methods. Results Hematoma within skin and/or muscle was found in the rats’hind limbs after contusion with three different heights.The repair processes were similar at 24 h after contusion.However,with the increase of height,the display degree was more obvious.At 3 d after contusion,the RBC of the hemorrhagic region would be decomposed and elapsed in 15 cm contusion group,but for 30 cm contusion group,it delayed to 7 d.At 13d after contusion,the similar result was found in 15cm and 30cm contusion groups,in contrast,the 50 cm contusion group was still in the proliferative phase.ConclusionWith the increase of height,the occurring rate of hematoma within skin and muscle at the same time increases,and the more serious histological appearance after contusion,including inflammation and proliferation,the longer healing process are observed.According to the results of present study and considering forensic application,the contusion model with 50cm height（2.58J/cm2）is recommended as the experimental animal model for the future study of wound age estimation on contusion.

forensic pathology;skin;contusions;muscle,skeletal;rats;wound age

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.001

1004-5619（2017）01-0001-05

2015-12-03）

（本文编辑：邹冬华）

国家自然科学基金资助项目（81172902，81373241）；上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（KF-116）

百茹峰（1977—），男，主任法医师，主要从事法医损伤学研究；E-mail：brf1000cn@aliyun.com

于天水，男，副教授，主要从事法医病理学研究；E-mail：30030005@qq.com