慢性肾功能衰竭患者线粒体基因组D-loop区突变研究

2017-03-24金劼彭政何援军姜聪娇黄百洋杜晓英

浙江医学 2017年5期

金劼彭政何援军姜聪娇黄百洋杜晓英

金劼彭政何援军姜聪娇黄百洋杜晓英

目的通过研究慢性肾功能衰竭（CRF）患者及家系成员中线粒体D-loop区的基因变异情况，探讨其与CRF发病之间可能的联系。方法收集42例CRF患者（CRF组）和95名家系成员（UAPM组），以及随机选取的122例正常人（对照组）的外周血，提取线粒体DNA，通过PCR扩增D-loop区并对产物纯化，然后进行基因测序来检测线粒体基因组D-Loop区域基因变异情况,并进行比较，分析该区域基因变异与CRF发病的可能相关性。结果通过与对照组及标准序列比较，共发现79个核苷酸改变，3个高频变异位点，其中总的碱基突变率在CRF组及UAPM组明显增加，两组与对照组碱基变异率差异均有统计学意义（均P＜0．01）。CRF组及UAPM组在D310区线粒体微卫星不稳定（mtMSl）及碱基变异率与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0．01）。结论线粒体基因组D-Loop区突变可能与CRF的发生、发展有一定的关系。

线粒体DNA D-loop 慢性肾功能衰竭微卫星不稳定突变

有关慢性肾功能衰竭（CRF）的发病机制报道较多，但有关自由基与CRF的相关研究较少。线粒体是细胞内活性氧的主要来源和靶位，也是细胞凋亡的主开关，线粒体的功能状态决定细胞的生死存亡。肾脏作为人体能量需求较大的器官之一，线粒体功能障碍将导致肾脏固有细胞损伤并诱导细胞凋亡；同时功能缺陷的线粒体产生的活性氧增加，会加重肾脏的氧化应激损伤。氧化应激可直接损伤线粒体DNA（mtDNA），使mtDNA易发生突变[1]。mtDNA多态性热点区域主要位于包括D-loop在内的非编码区域[2]。本研究通过检测CRF患者及家系成员的mtDNA D-loop区单核苷酸多态性，并与正常人进行对比，观察mtDNA的突变与CRF发病的关系,现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象收集2012年3月至2013年8月在浙江衢化医院诊断为慢性肾脏病（CKD）并有完整随访资料的CRF患者42例（CRF组）及肾功能正常的家系成员（UAPM）95名（UAPM组）的资料和外周血标本。入选标准：按2002年美国肾脏基金会“肾脏病预后质量倡议”（KDOQI）指南诊断为CRF的患者；籍贯为浙江省；患者均为初诊CRF且之前未接受透析、肾移植以及其他生物学治疗。CKD的诊断参照2002年KDOQI指南[3]。另选取2008年12月至2009年3月于温州医学院附属第一医院体检中心122例汉族人的资料和外周血标本作为对照组[4]，从血液中提取线粒体DNA并测序进行组间对照。3组一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表1。

表1 3组一般资料的比较

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取收集受试对象外周血5～10ml，置于-70℃低温冰箱保存备用。DNA提取采用Blood Genomic/Mitochondrial DNA Extraction Kit（美国杰美基因有限公司GenMed全血基因组/线粒体DNA同步萃取试剂盒），按照说明书对冻存外周血同时提取线粒体DNA和基因组DNA。通过化学溶解纯化血白细胞、物理或化学破膜及离心处理方法，从全血样品中分离出完整而纯化的细胞核和线粒体细胞器，然后进一步用生物酶处理分别获得高质量的基因组和线粒体DNA。提取的DNA在紫外分光光密度仪上进行定量，并置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 线粒体DNA D-loop PCR分析在网络 mitomap.org查询人mtDNA的剑桥序列（GenBank#J01405.0 gi:337188），mtDNA的D-loop区位于1～576和16024～16569。用于扩增mtDNA D-loop及邻近编码区引物：R: 5′-GAA TCG GAG GAC AAC CAG TA-3′S:5′-TGA TGT GAG CCC GTC TAA AC-3′，引物的合成与纯化由上海基康科技公司完成。PCR扩增条件:94℃预变性5min，94℃变性35s，62.5℃复性35s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃再延伸10min。反应结束后，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，120V电压和60mA下60 min。凝胶成像仪上观察、记录、拍照。

1.2.3 PCR产物测序分析扩增产物经琼脂糖凝胶电泳观察，有目的条带出现后，进行DNA测序，测序反应用ABI PRISM BigDyeTM循环测序反应试剂盒（德国Weiterstadt公司），在ABI Prism377测序仪（美国PE公司）上进行，测序反应用的引物同PCR反应的引物。对已扩增并纯化的42例CRF标本，95例UAPM标本，122例对照组标本的PCR产物进行序列测定。序列测定工作主要由北京六合华大基因科技股份有限公司上海测序部完成。测序结果用CodonCodeAligner2.0.6软件对峰图的质量进行评价，测序峰图质量低的标本安排重新测序。可用的测序结果以修正后的剑桥序列（rCRs）作为参考序列，用基于phred/phrap/consed序列拼接程序的 Windows图形界面处理软件包 CodonCodeAligner2.0.6进行分析。数据分析时，利用CodonCode Aligner软件中的Assemble和Findmutations功能，将所有需要比对的序列进行拼接和比对，同时与参考序列比对，以查找突变和分析SNP位点。最后以Chromas软件来观察具体的峰图形状以确定是否确有突变发生（修正后的rCRs来源于线粒体基因组数据www.Mitomap.org,gi号为 AC_000021.2，序列拼接分析所用软件 Codon-CodeAligner2.0.6,下载地址 http://www.Codoneode.corn/ aligner/download.htm）。

1.3 统计学处理采用SPSS16.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以频数和百分率表示，组间比较采用χ2检验及Fisher精确概率法。

2 结果

2.1 3组变异性分析 CRF组、UAPM组和对照组中总碱基突变数分别为412、760和832，在79个变异位点中，91.1%（72/79）是同质性突变，8.9%（7/79）为异质性突变。其中有存在3个高频变异位点分别是np73A-G, np263A-G和D310。其中CRF组42例及UAPM组95例均存在np73A-G和np263A-G突变，对照组分别存在108例np73A-G和105例np263A-G突变[4]，经统计学分析，除了D310外，其他单个变异位点在实验组与对照组间的分布差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 各组碱基变异率比较碱基变异率（变异碱基总数/所测碱基总数×100%）CRF组 0.88%[412/（42× 1120）]，UAPM组0.71%[760/（95×1120）]，对照组0.61% [832/（122×1120）]，CRF、UAPM组与对照组比较差异均有统计学意义（χ2=37.071、10.209，均P＜0.01）。

2.3 D310区的线粒体微卫星不稳定（mtMSl）及碱基变异率分析见表2。

由表2可见，对所有标本的D310区进行微卫星不稳定（MSl）分析显示，CRF组、UAPM组共有119例存在MSI，CRF组、UAPM组与对照组变异频率比较差异均有统计学意义（χ2=30.076、18.217，均P＜0.01）；CRF组、UAPM组与对照组碱基变异率比较差异亦均有统计学意义（χ2=106.078、61.691，均P＜0.01）。

表2 D310区的mtMSl及碱基变异率统计分析

3 讨论

线粒体是细胞有氧代谢和生成活性氧的关键场所。细胞内和线粒体内诸多抗氧化系统可以调节线粒体内活性氧的生成，从而维持正常生理条件下细胞内活性氧的平衡。线粒体活性氧稳定状态的打破，成为机体产生疾病和引发衰老的重要因素。当产生和清除活性氧的平衡被打破，即出现氧化应激时，mtDNA易受氧化损伤，mtDNA突变亦大大增加，最终导致线粒体功能障碍，当线粒体氧化磷酸化产生ATP障碍时，可释放高水平的活性氧，从而进一步激活细胞凋亡及对核基因组的损伤[5-6]。

在mtDNA突变与慢性肾脏疾病的研究方面，有学者研究了存在mtDNA4696bp缺失突变的小鼠模型早期即发生局灶节段硬化性肾小球肾炎（FSGS），并在6月龄时死于终末期肾功能衰竭，且在受损器官中肾组织mtDNA突变蓄积最为显著[7]；Doleris等[8]报道了FSGS与线粒体功能障碍具有相关性；张胜雷等[9]认为D-loop区的突变可能会导致mtDNA复制和基因表达异常，引起线粒体功能异常和氧化应激的发生，最终导致包括CKD在内的各种慢性疾病的发生，发现mtDNA的D-loop区多态性与CKD患者肾脏生存预后有一定关联性。

本研究结果发现在CRF和UAPM组中，总碱基突变率在CRF患者及家系成员中明显增加，各实验组与对照组间的碱基变异率分布差异均有统计学意义，表明随着变异的增多，患CRF的风险可能增大。同时发现存在3个高频变异位点分别是np73A-G，np263A-G和D310。经统计学分析，除了D310外，其他单个变异位点在实验组与对照组间的分布差异无统计学意义，推测它们可能为多态性改变，这也与张幼芳[10]的研究结果相一致。

D-loop区303～315（D310）单核苷重复性位点（C-stretch）更易被氧化磷酸化损伤和亲电子攻击，因而也成为mtDNA突变的研究热点，D310的C-stretch也是最多发现线粒体微卫星多态性的区域。对所有标本的D310区进行MSl分析显示，实验组中分别有42例和77例存在MSI，与对照组比较，D310区发生MSI的频率及碱基变异率差异有统计学意义，该区与对照组比较，差异同样具有统计学意义，表明在患有CRF的患者及家系成员与正常人相比，MSI增加。

有学者观察到mtDNA的突变经常发生在D310附近,而这个区域负责RNA-DNA的形成,从而开始mtDNA的复制[11]，因此一旦发生不稳定将影响其功能的发挥。另外，由于D-Loop区是编码蛋白质的控制区, mtDNA D-Loop区128～599片段包含了其H链上控制mtDNA复制与转录的大部分区域,尤其是mtDNA的突变热点区D310的C-stretch位于这一区域内,在该区域的位点突变可能增加了慢性肾功能衰竭的发病易感性和疾病发展进度。

线粒体DNA D-Loop区突变与CRF的发生、发展可能存在直接的相关性,但这些研究结果均有待进一步增加样本数来证实，同时其具体的分子作用机制也有待将来进一步的实验证实。

[1]Carew J S,Zhou Y,Albitar M,et al．Mitochondrial DNA mutations in primary leukemia cells after chemotherapy:clinical significance and therapeutic implications[J]．Leukemia,2003,17(8):1437-1447．

[2] Lee H C,Li S H,Lin J C,et al．Somatic mutations in the D-loop and decrease in the copy number of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma[J]．Mutat Res,2004,547:71-78．

[3]王海燕,王梅．肾脏病及透析的临床实践指南[M]．北京:人民卫生出版社,2003:467-481．

[4] Peng Z,Xie C Y,Wan Q Y,et al．Sequence variations of mitochondrial DNA D-loop region are associated with familial nasopharyngeal carcinoma[J]．Mitochondrion,2011,11:327-333．

[5] Hayakawa M,Ogawa T,Sugiyama,et al．Massive conversion of guanosine to 8-hydroxy-guanosine in mouse liver mitochondrial DNA by administration of azidothymidine[J]．Biochem Biophys Res Commun,1991,176(1):87-93．

[6] Alfadda A A,Sallam R M．Reactive oxygen species in health and disease[J]．J Biomed Biotechnol,2012,13(6):304-310．

[7]Inoue K,Nakada K,Ogura A,et al．Generation of mice with mitochondrial dysfunetion by introducing mouse mtDNA carrying a deletion inio zygotes[J]．Nat Genet,2000,26:176-181．

[8] Doleris L M,Hill G S,Chedin P,et al．Foeal segmental glomerulosclerosis associated with Mitochondrial cytoPathy[J]．Kidney Int,2000,58:1851-1858．

[9] 张胜雷,金升,白亚玲,等．慢性肾脏病患者肾脏生存预后与线粒体DNAD-loop基因多态性的关系[J]．中华肾脏病杂志,2014,30(3): 227-228．

[10]张幼芳．浙江汉族群体线粒体DNA多态性调查[J]．浙江警察学院学报,2007,3:107-108．

[11] Lee D Y,Clayton D A．Initiation of mitochondrial DNA replication by ranscription and R-LOOP processing[J]．J Biol Chem,1998, 273(46):30614-30621．

Mutations of mitochondrial DNA D-loop region in patients with chronic renal failure

Objective To investigate the sequence variations of mitochondrial D-loop region in chronic renal failure patients and family members．MethodsForty two patients with chronic renal failure(CRF group)and 95 unaffected pedigree members(UAPM group)were recruited in the study,and 122 healthy subjects served as normal controls(NC group)．Mitochondrial DNA(mtDNA)was extracted from peripheral blood and the D-loop sequence variations were examined by PCR-based assay．The association between D-Loop gene variations and chronic renal failure was analyzed． Results Compared with normal control,79 sequence variants were detected,mtDNA exhibited a high rate of sequence variants in patients with CRF and pedigree members．Among these,three high variations were found and base variation rate in CRF and UAPM groups were significantly higher than that in normal control group(P＜0．01)．The occurrence of mtMSI at D310 in CRF and UAPM groups were higher than that in normal control group(P＜0．01)．Conclusion Genome mutations in mitochondrial D-Loop may be relate to the development of chronic renal failure．

Mitochondrial DNA D-loop Chronic renal failure Microsatellite instability Mutation