具有神经生长因子缓释功能的聚羟基脂肪酸酯膜片的制备及其对PC12细胞神经分化的研究

陈曦，高力，雷静

(自贡市第四人民医院神经外科1、检验科2，四川 自贡 643000)

具有神经生长因子缓释功能的聚羟基脂肪酸酯膜片的制备及其对PC12细胞神经分化的研究

陈曦1，高力1，雷静2

(自贡市第四人民医院神经外科1、检验科2，四川 自贡 643000)

目的 制备一种可缓慢释放神经生长因子(NGF)的的高分子复合材料，用于神经组织工程的研究。方法采用溶剂挥发的方式，将NGF与聚羟基脂肪酸酯(PHA)在有机溶剂中充分混合，再将其倒入圆形玻璃器皿中，形成一个表面和内部都含有NGF的PHA膜，并将纯的PHA膜和浸泡干燥的PHA膜(粘附NGF的PHA膜)作为对照。将上述三种膜分别进行微观形貌(扫描电子显微镜)、水接触角和NGF体外释放的检测。最后，在连续培养6 d后，观察三种膜对PC12细胞的神经分化影响。结果相对于两个对照组，负载NGF的PHA膜表面形貌更起伏粗糙，有明显的蛋白粘附，也具有最佳的亲水性。同时，负载NGF的PHA膜能连续6天释放出稳定的且有活性的NGF，浓度大于100 ng/mL。负载NGF的PHA膜上的PC12细胞分化明显，在培养第3天时出现神经样细胞的分化表型，长出了轴突，而第6天邻近的几个PC12细胞的轴突相互接触并形成类似神经网结构；其他对照组没有明显现象。结论成功利用生物材料PHA制备出一种具有NGF缓释功能的生物高分子膜片，并可诱导PC12细胞向神经细胞表型分化。

神经生长因子；聚羟基脂肪酸酯；神经组织工程；缓释

神经生长因子(NGF)是一种昂贵的神经分化生长因子，且使用半衰期较短，通常只有几个小时[1-2]。一次性局部给药后NGF能发挥生物活性功能的时间十分有限，这在一定程度上限制了其在临床上的应用[3-4]。因此，需要寻求一种可长期释放具有功能活性NGF的缓释方法，以避免上述困难。近年来，越来越多的尝试利用组织工程和缓释载体的思维解决生长因子的缓释问题。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种从微生物中提取的生物聚酯材料，由300多种单体组合而成，是一种全新的生物材料[5]。由于具有良好的生物相容性和生物可降解性，PHA逐渐被大家用于组织工程和药物载体领域的研究，并取得了较好的成果[6]。但目前还无人做将NGF包裹在PHA中的尝试，特别是最新的PHA材料P(3HB-co-4HB)，形成可缓释NGF的PHA膜，并用于PC12神经分化的研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 聚羟基脂肪酸酯[P(3HB-co-4HB)，相对分子质量为20×104]购于意中国可曼生物材料有限公司。日本电子日本电子株式会社(JEOL)生产的扫描电子显微镜；日本奥林巴斯倒置荧光显微镜；承德金和仪器制造有限公司生产的接触角水滴角测量仪；所有细胞培养试剂、耗材和NGF均购于美国赛默飞公司(Thermo，Gibco)。

1.2 方法 (1)制备PHA膜：将1 g的PHA溶解于10 mL的体积比为1:1的二氯甲烷/丙酮混合有机溶液中，使用20℃、200 r/min的磁力搅拌器搅拌使其充分溶解；将溶液倒入直径为7 cm的圆形玻璃器皿中，待二氯甲烷完全挥发，得到聚羟基脂肪酸酯膜片。(2)制备表面粘附NGF的PHA膜：将上述所制备的PHA膜浸泡在4℃的100 mg/mL NGF溶液中，取出冷冻干燥。(3)制备负载NGF的PHA膜：与PHA膜的制备相似，将1 g的PHA溶解于10 mL的体积比为1:1的二氯甲烷/丙酮混合有机溶液中，在20℃、200 r/min的磁力搅拌器使其充分溶解；再加入20 mg的NGF粉末，继续溶解5 min；将溶液倒入直径为7 cm的圆形玻璃器皿中，待二氯甲烷完全挥发得到负载NGF的聚羟基脂肪酸酯膜片。(4)观察和分析三种PHA膜的理化性质：分别将上述制备的PHA膜切下相等大小的一小片(约1 cm×0.5 cm)，用导电胶粘在金属台上，喷Pt金60 s，抽真空处理后，采用扫描电镜(SEM)观察膜的表面结构；另取同样大小的膜片粘附在载物台上，滴加10 μL的超纯水在膜表面，用于接触角检测。(5)NGF的缓释能力：将粘附NGF的PHA膜和负载NGF的PHA膜裁剪成48孔板大小的圆形，分别浸泡在2 mL的37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH= 7.4)中静态处理，每天换液并收集PBS；并采用ELISA试剂盒，对每个时间点的样品中的NGF含量进行检测。(6)膜片上的PC12的培养：先将膜片切割成48孔板大小，并进行紫外杀菌处理；将购买的PC12细胞复苏并培养在F12培养液(含5%胎牛血清、15%马血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素)，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；传代2次后以2×104个细胞接种于孔培养板上，接种在48孔板的膜片上，隔日换液，连续培养10 d。(7)膜片上的PC12神经分化效果测试：连续培养10 d后，分解在培养的第3天和第6天进行染色及荧光显微镜观察，分别将三种膜片依次进行PBS清洗、含1%DIO的培养基染色培养10 min、PBS再次清洗除去残余的DIO、加入新鲜的培养基、荧光显微镜观察。

2 结 果

2.1 三种PHA膜的表面形貌 通过SEM观察发现，单纯的PHA膜表面较光滑；浸泡后表面粘附NGF的PHA膜表面有明显的蛋白附作物；负载NGF的PHA膜表面形貌更起伏粗糙，且也发现明显的蛋白附作物(图1)。

2.2 三种PHA膜的亲水性对比 采用纯水的接触角检测法，发现三种膜片的亲水性分别是负载NGF的PHA膜＞粘附NGF的PHA＞PHA膜(图2A)。且负载NGF的PHA膜与PHA膜差异具有统计学意义(P＜0.05)。这说明亲水性与NGF的混合比例和方式有关。

2.3 NGF的释放能力检测 通过ELISA试剂盒，检测出负载NGF的PHA膜和粘附NGF的PHA所释放出的NGF含量(图2B)。结果表明，两种PHA膜片都能释放出不同浓度的NGF，第1天，粘附NGF的PHA膜释放的NGF浓度为460.72 ng/mL，大于负载NGF的PHA膜的357.39 ng/mL，差异具有统计学意义(P＜0.05)。第2天，粘附NGF的PHA膜释放的NGF浓度只检测出18.94 ng/mL，而负载NGF的PHA膜依然保持着257.54 ng/mL的强劲NGF释放能力，两者差异有统计学意义(P＜0.005)。粘附NGF的PHA膜在第3天就无法检测到NGF，而负载NGF的PHA膜从第3天到第6天均能检测出，且浓度维持在100～130 ng/mL之间，说明负载NGF的PHA膜具有良好的NGF缓释功能，且释放的NGF浓度基本满足PC12神经分化的需求。

2.4 膜片上的PC12神经分化 通过荧光显微镜观察发现，不论是培养第3天还是第6天，PHA膜上的PC12没有任何神经分化的迹象；负载NGF的PHA膜上的PC12细胞分化明显，在第3天时出现神经样细胞的分化表型，长出了轴突，而第6天邻近的几个PC12细胞的轴突相互接触并形成类似神经网结构；而只是表面粘附少量NGF的PHA膜也表现出微弱的现神经样细胞分化现象，但远低于负载NGF的PHA膜，见图3。这验证了负载NGF的PHA膜释放的NGF具有生物活性，可以诱导PC12细胞向神经细胞表型分化。

图1 三种PHA膜的微观结构对比

图2 释放浓度对比

图3 三种PHA膜上培养PC12细胞的荧光显微镜图

3 讨 论

目前已知，NGF对神经元或类神经元细胞的生长发育及特殊的功能维持都有着重要作用。通常情况下NGF大于50 ng/mL时，即可诱导PC12细胞模型进行神经分化[1]，具体表现为：(1)数量上，细胞的增埴能力逐步停止，细胞数量不再增加；(2)形态上，出现细胞平展、细胞质附属物的形成及细胞膜变皱褶等现象，并胞体逐步长出突起；(3)分子生化功能上，出现氨基酸的转运加强、离子泵的改变及相关蛋白质的磷酸化等现象，且细胞表面逐步出现神经细胞所特有的细胞膜电位。由于这种特异地分化使其在形态外观及生理功能方面都更接近于神经元，PC12是最佳的神经元分化的体外模型。PHA是一种从微生物中提取的生物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，已在组织工程和药物载体领域的进行大量的研究[6]，也是一种潜在的神经组织工程材料。但目前为止，没有关于NGF包裹在PHA中可缓释NGF的任何报道。

本课题尝试将NGF包裹在最新的一种PHA材料，即P(3HB-co-4HB)，构建一种可缓释NGF的PHA膜，并能刺激PC12进行神经分化。与NGF只是简单地粘附在PHA膜表面相比，将PHA与NGF充分混合后，采用溶剂挥发的方式将NGF均匀的分散在PHA膜的表面和内部，更有利于实现NGF的缓慢释放。结果表明，负载NGF的PHA微观形貌和单纯的浸泡粘附NGF的PHA膜更粗糙。通过体外缓释检测发现，在6 d(每天换液)的测试中，负载NGF的PHA膜均能持续释放出浓度大于100 ng/mL的NGF，而粘附NGF的PHA膜只有在第一天能达到上述浓度。通过PC12细胞的种植和分化效果也进一步验证了上述观点。通过6天的连续培养，只有负载NGF的PHA膜能成功实现多个PC12细胞的轴突相互接触及类似神经网结构的形成，对照组无法实现。

综上所述，通过NGF与PHA混合制备的膜可有效地进行NGF的缓释，且能促进PC12神经分化，是一种全新的具有生长因子缓释功能的复合材料，具有较好的神经组织工程科研及临床意义，前景广阔。

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[2]Zuidema JM,Provenza C,Caliendo T,D et al.Magnetic NGF-releasing PLLA/iron oxide nanoparticles direct extending neurites and preferentially guide neurites along aligned electrospun microfibers[J]. ACS Chemical Neuroscience,2015,6(11):1781-1788.

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Preparation of polyhydroxyalkanoate film with NGF-slow release and its effect on neural differentiation of PC12 cells.

CHEN Xi1,GAO Li1,LEI Jing2.Department of Neurosurgery1,Department of Clinical Laboratory2,Zigong Fourth People's Hospital,Zigong 643000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo study the preparation of polyhydroxyalkanoate(PHA)film with nerve growth factor (NGF)slow release and its effect on neural differentiation of PC12 cells.MethodsNGF and PHA were mixed thoroughly in the organic solvent through solvent evaporation method.Then the solvent was poured into a round glass container to form a PHA film containing NGF inside and outside.The pure PHA film and the soaked dry PHA film(PHA film attached NGF)were regarded as the control groups.The three kinds of films were characterized by microstructure (SEM),water contact angle measurement and NGF release assay respectively.After 6 consecutive days of culturing,the effects of three kinds of films on neuronal differentiation of PC12 cells were observed.ResultsCompared by the twocontrol groups,the surface of PHA films loaded with NGF appeared rougher,and had obvious protein adhesives and the best hydrophilia.Meanwhile,the PHA films loaded with NGF could release the active NGF whose concentrations exceeded 100 ng/ml for 6 consecutive days steadily.The PHA films loaded with NGF had the obvious differentiation.On the third day of culturing,the differentiation phenotype of neuron-like cells appeared and the axons grew;on the sixth day of culturing,the axons of neighboring PC12 cells contacted with each other and formed a structure of resembling neural network.While,the control groups had no obvious differentiation phenomena.ConclusionIn this study,a biopolymer biomembrane with a slow-release function of NGF was successfully prepared and the PC12 cells were induced to differentiate into neuronal cells.

Nerve growth factor(NGF);Polyhydroxyalkanoate(PHA);Nerve tissue engineering;Slow release

R741

A

1003-6350（2017）04-0530-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.004

2016-08-15)

雷静。E-mail：601769459@qq.com