乳腺癌组织及间质浸润淋巴细胞中PD-L1的表达及其意义

黄述斌，侯永微，李松梅，王志强，徐 亮，王海平

乳腺癌组织及间质浸润淋巴细胞中PD-L1的表达及其意义

黄述斌，侯永微，李松梅，王志强，徐 亮，王海平

目的探讨程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）在乳腺癌组织及间质浸润淋巴细胞（stromal tumor-infiltrating lymphocyte，sTIL）中的表达及其与临床病理特征的关系。方法收集 68例乳腺非特殊性浸润性癌，采用免疫组化EliVision两步法检测PD-L1蛋白表达，并分析其与免疫组化亚型及临床病理特征的关系。结果乳腺肿瘤细胞中PD-L1总阳性率为35.3%，尤其在三阴型乳腺癌肿瘤细胞中的阳性率最高，在管腔型、HER-2过表达型及三阴型乳腺癌肿瘤细胞中的阳性率分别为16.1%、37.5%、61.9%，差异有统计学意义。PD-L1在 sTIL中的总阳性率为51.5%，且在三阴型乳腺癌中最高，阳性率为81.0%；PD-L1在管腔型、HER-2过表达型及三阴型乳腺癌 sTIL中的表达差异具有统计学意义。PD-L1在乳腺癌与sTIL中的表达呈正相关。结论PD-L1在三阴型乳腺癌中表达明显高于其他类型乳腺癌，阻断 PD-L1／PD-1信号通路，有望成为乳腺癌尤其是三阴型乳腺癌免疫治疗的新策略。

乳腺肿瘤；免疫组化亚型；程序性死亡配体-1；免疫治疗

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其基因表达谱分型对指导临床治疗非常重要，目前被广泛使用的是用免疫组化替代基因谱分析进行分型，依据ER、PR、HER-2、CK5／6、EGFR以及Ki-67的表达，将其分为管腔A型、管腔B型、HER-2过表达型、基底细胞样型和未分类型；其中基底细胞样型和未分类型统称为三阴型乳腺癌［1］。管腔型和 HER-2过表达型目前均有成熟的靶向治疗药物，但三阴型乳腺癌尚未有特异性的靶向药物，采用常规化疗不敏感；某些靶向药物治疗效果不佳的患者在后期缺乏有效的治疗方案。因此，寻找乳腺癌尤其是三阴型乳腺癌的治疗靶点是当务之急。

程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是负性共刺激分子 B7家族成员，其在肺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中表达水平较高，针对性的靶向药物MPDL3280A在临床试验中有较好效果。国外文献对乳腺癌中 PD-L1的表达已有相关报道，但国内文献报道较少。本文采用免疫组化EliVision两步法检测68例不同免疫组化亚型非特殊性乳腺浸润性癌以及肿瘤间质浸润淋巴细胞（stromal tumor-infiltrating lymphocyte，sTIL）中 PD-L1的表达，分析其差异及与临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料收集池州市人民医院 2014年1月 ～2016年4月手术切除的有完整资料的 68例乳腺非特殊性浸润性癌，术前均未接受辅助化疗。所有病例均经我院两位高年资病理医师确诊并提取原有免疫组化结果重新评估，依据文献中免疫组化替代分型方案分为五种免疫组化亚型：管腔 A型、管腔B型、HER-2过表达型、基底细胞样型和未分类型。其中管腔 A型和 B型统称为管腔型，基底细胞样型和未分类型统称为三阴型。标本均经 10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。

1.2 方法免疫组化染色采用 EliVision两步法，兔抗人PD-L1单克隆抗体（SP142）及EliVision检测试剂盒均购自福州迈新公司；具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用胎盘组织作为阳性对照，乳腺癌旁正常乳腺组织作为阴性对照，PBS代替一抗作为空白对照，DAB显色，苏木精衬染。

1.3 结果判读PD-L1染色阳性为胞膜和（或）胞质出现棕黄色颗粒。PD-L1染色结果根据阳性细胞所占百分率进行半定量分析［2］：阳性细胞数 ＜1%为（－），1%～5%为（＋），6%～10%为（⧺），＞10%为（⧻）；肿瘤浸润淋巴细胞的判定依据国际TIL评价工作组推荐［3］，以 sTIL作为分析对象，评分方法同上；（－）为阴性，（＋～⧻）为阳性。

1.4 统计学分析采用 SPSS 16.0软件进行统计学分析，PD-L1表达与免疫组化亚型及临床病理特征的关系、肿瘤细胞与 sTIL中表达相关性均采用 χ2检验或Fisher确切概率法分析，各因素间的关系应用多因素 Logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特点68例非特殊性乳腺浸润性癌患者均为女性，年龄 32～86岁，平均（55.4±12.7）岁；肿瘤最大径0.8～9 cm，平均（3.2±1.6）cm；淋巴结转移 40例（58.8%）。组织学分级：Ⅰ级4例（5.9%）、Ⅱ级 38例 （55.9%）、Ⅲ级 26例（38.2%）。管腔型31例（45.6%）、HER-2过表达型16例（23.5%）、三阴型21例（30.9%）。

2．2 PD-L1在肿瘤及 sTIL中的过表达及与临床病理特征的关系PD-L1过表达与患者年龄、肿瘤大小和淋巴结是否转移无关，但在肿瘤细胞和 sTIL中的表达均与病理分级有关。PD-L1在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤细胞中阳性率分别为 0.0（0／4）、26.3%（10／38）、42.3%（14／26）；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤sTIL中的阳性率分别为 25.0%（1／4）、39.5%（15／38）、73.1%（19／26），差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。多因素 Logistic回归分析结果显示，只有病理分级对肿瘤细胞阳性率和 sTIL阳性率具有显著的影响作用，与病理分级为Ⅰ级相比，Ⅲ级患者的肿瘤阳性率和 sTIL阳性率分别增加了 10.27（2.44～43.28）和9.06（2.12～38.79）倍。

2．3 PD-L1在肿瘤细胞中的表达与乳腺癌免疫组化亚型的关系乳腺浸润性癌周围间质往往存在淋巴细胞浸润（图1），PD-L1在35.3%的浸润性乳腺癌肿瘤细胞中表达，表现为胞膜和（或）胞质阳性（图2），其中在三阴型乳腺癌中的阳性率最高，在管腔型、HER-2过表达型及三阴型乳腺癌中的阳性率分别为16.1%（5／31）、37.5%（6／16）、61.9%（13／21），差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2．4 PD-L1在 sTIL中的表达与乳腺癌免疫组化亚型的关系PD-L1在51.5%的浸润性乳腺癌的sTIL中表达（图3），其中在三阴型乳腺癌 sTIL中的阳性率最高，在管腔型、HER-2过表达型及三阴型乳腺癌的sTIL中阳性率分别为 35.5%（11／31）、43.8%（7／16）、81.0%（17／21），差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

2．5 PD-L1在肿瘤细胞与 sTIL中表达的相关性

PD-L1在肿瘤细胞及 sTIL中的表达呈明显正相关（χ2＝8.067，P＝0.004 5，表4），部分病例在肿瘤细胞与sTIL中 PD-L1均呈强阳性。

表1 PD-L1在肿瘤细胞和sTIL中的表达及与乳腺癌临床病理特征的关系

表2 PD-L1在肿瘤细胞中表达与乳腺癌免疫组化亚型的关系［n（%）］

表3 PD-L1在sTIL中表达与乳腺癌免疫组化亚型的关系［n（%）］

图1 A.肿瘤周围少量间质浸润淋巴细胞；B.肿瘤周围中等量间质浸润淋巴细胞；C.肿瘤周围大量间质浸润淋巴细胞 图2 A.肿瘤细胞中PD-L1呈（＋），EliVision两步法；B.肿瘤细胞中PD-L1呈（⧺），EliVision两步法；C.肿瘤细胞中PD-L1呈（⧻），EliVision两步法 图3 A.sTIL中PD-L1呈（＋），EliVision法；B.sTIL中PD-L1呈（⧺），EliVision两步法；C.sTIL中PD-L1呈（⧻），EliVision两步法

表4 PD-L1在肿瘤细胞与 sTIL中表达的相关性［n（%）］

3 讨论

PD-L1是相对分子质量为4.0×104的Ⅰ型跨膜蛋白，通常免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生。细胞程序化死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）与PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，下调抗原刺激的淋巴细胞增殖及细胞因子的产生，最终导致淋巴细胞“耗尽”以及诱导免疫耐受［4－5］。PD-L1除表达于肿瘤周围的 sTIL外，还可以在不同的恶性肿瘤如肺癌［6－8］、膀胱癌［9］、恶性黑色素瘤［10］等肿瘤细胞中表达。有文献报道肿瘤细胞能够逃避免疫监视，其中可能的重要机制是 PDL1表达于肿瘤细胞，其表达水平与肿瘤的不良预后有相关性。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其中三阴型乳腺癌目前尚未有特异性的靶向药物，常规化疗效果不佳。本实验结果显示 54.4%的乳腺非特殊性浸润性癌表达 PD-L1，其中在三阴型乳腺癌中阳性率为81.0%；三阴型乳腺癌中 PD-L1在肿瘤细胞和sTIL中的表达比管腔型和 HER-2过表达型均更高，与 Cimino-Mathews等［11］报道一致。Ghebeh等［12］发现乳腺癌PD-L1的阳性率为50%，其中34%在肿瘤上皮细胞中表达，41%在sTIL中表达；他们发现PDL1在瘤内的表达与组织学分级和激素受体阴性有关。本组结果也显示PD-L1在肿瘤细胞及 sTIL中的表达均与组织学分级有关，以高级别的浸润性癌表达最为显著。Ali等［13］发现PD-L1在原发性乳腺癌中的总阳性率较低，但约 1／5的基底样细胞型肿瘤含有浸润的免疫细胞且表达 PD-L1。通过对 PDL1的扩增观察发现基底样细胞癌受PD-L1的影响，虽然病例较少，但却发生在所有的基底细胞样肿瘤中。提示 PD-L1抑制药可能对一小群表达 PD-L1的乳腺癌女性患者（大部分为基底样细胞型）有效。Mittendorf等［14］通过 RNA序列分析数据显示 PD-L1在三阴型乳腺癌中的表达明显高于非三阴型乳腺癌（P＜0.001）；他们发现PTEN缺失是在转录水平调控PD-L1的一种机制，它是通过PI3K通路信号发挥作用。三阴型乳腺癌中 PD-L1表达的增加对T细胞产生功能性影响，包括 T细胞增殖的减少和凋亡增多。

然而，Muenst等［15］研究显示PD-L1表达与 Ki-67／HER-2的表达呈正相关，与 ER表达呈负相关，与 PR表达无关，在不同的乳腺癌亚型中无明显差异。这与本组 PD-L1在三阴型乳腺癌中表达明显高于其他类型的结果不同，可能是由于 Muenst等［15］的研究样本采用的是 TMA，而 PD-L1在肿瘤中的表达具有异质性，组织芯片样本的局限性可能导致结果的差异。有文献报道［16］，利用体内影像技术进行PD-L1检测，可以观察肿瘤细胞整体的 PDL1表达情况和分布规律，避免表达异质性对实验结论的影响，提高 PD-L1作为疗效预测指标的准确率。

Beckers等［2］发现肿瘤细胞与sTIL中同时表达PD-L1与预后好有关。本组结果显示相对于PD-L1肿瘤阴性区域，肿瘤阳性区域周围间质浸润淋巴细胞明显增多，且表达PD-L1也增强。统计数据表明，PD-L1在肿瘤细胞与sTIL中的表达呈正相关，提示PD-L1在肿瘤细胞中的表达直接受PD-L1＋sTIL的影响，其是否与肿瘤的预后直接相关，尚需进一步随访；Pardoll［17］也支持该观点，其认为在肿瘤微环境中，免疫细胞产生的炎性因子如干扰素能上调肿瘤细胞表面 PD-L1的表达，并形成正反馈环路是肿瘤细胞逃避获得性免疫的一种可能性机制。

PD-L1在乳腺癌中的部分病例中表达，在三阴型乳腺癌中表达明显高于其他类型乳腺癌；其在肿瘤细胞和 sTIL中均有一定的阳性率，其表达与肿瘤的病理分级有关，且在肿瘤细胞中的表达与在 sTIL中的表达呈正相关。PD-L1在乳腺癌中的表达可能有多种机制，阻断 PD-L1／PD-1信号通路，有望成为乳腺癌尤其是三阴型乳腺癌免疫治疗的新策略。

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Expression and significance of PD-L1 in breast cancer tumor cells and tumor-infiltrating lym phocytes

HUANG Shu-bin，HOU Yong-wei，LISong-mei，WANG Zhi-qiang，XU Liang，WANG Hai-ping
（Department of Pathology，the People’s Hospital of Chizhou，Chizhou 247100，China）

PurposeTo investigate the expression of programmed death ligand-1（PD-L1）in breast cancer tumor cells and stromal tumor-infiltrating lymphocyte（sTIL），and to study the relationship between the expression of PD-L1 and the clinicopathological characteristics of the patients.M ethodThe protein expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry of EliVision two-step method in 68 cases of non special type of invasive breast cancer，and the relationship between the expression of PD-L1 protein and the immunohistochemistry subtypes and clinical parameters was analyzed.ResultsThe total expression rate of PD-L1 was 35.3%in breast tumor tissue，specially in triple negative breast cancer（TNBC）which occupy the highest positive rate.The expression rates of PD-L1 in tumor tissue of the luminal subtype，HER-2 over-expression subtype and TNBC subtype were 16.1%，37.5%and 61.9%respectively，and the difference was statistically significant.The total expression rate of PD-L1 in sTIL was 51.5%，and the highest expression rate was 81.0%in TNBC.There were significant differences of PD-L1 expression in sTIL of the luminal subtype，HER-2 over-expression subtype and TNBC subtype.Expression of PDL1 in tumor tissue and sTIL had a significant positive correlation.ConclusionPD-L1 expressed in TNBC was significantly higher than other types of breast cancer，which suggest the blocking of signal pathway of PD-1／PD-L1 may expected to become a new immunotherapy for breast cancer，especially for TNBC subtype.

breast neoplasm；immunohistochemistry subtype；programmed cell death ligand-1；immunotherapy

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0063－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.016

接受日期：2016－11－10

安徽省池州市人民医院病理科 247100

黄述斌，男，硕士，副主任医师。

E-mail：iamhuangsb1978＠sina.com