大鼠脑组织高尔基染色三种制备方法的比较

王 蕾，张 芳，汤仁仙，张冠群，牛海晨

大鼠脑组织高尔基染色三种制备方法的比较

王 蕾1，张 芳1，汤仁仙1，张冠群2，牛海晨3

脑组织；高尔基染色法；冷冻切片；振动切片；石蜡切片

1873年意大利著名的神经解剖学家卡米洛·高尔基发明硝酸银染色法，从此可以定性定量地观察神经元的形态［1］。随后 Cox等［2－4］对高尔基染色法的固定液和染色液进行改良，提高结果的可视性，但初学者选择合适的染色方法仍较为困难。本实验采用相同的固定、染色和显色液，采用不同的制作方法（冷冻切片、石蜡切片、振动切片）进行大鼠脑组织高尔基染色，比较三种制作方法各自的优缺点，为科研实验和制作典型的教学示教切片提供可选方法。

1 材料与方法

1.1 动物SD大鼠 3只，体重220～240 g，实验操作经徐州医科大学动物伦理审查委员会批准。

1.2 取材首先SD大鼠经10%水合氯醛（国药30037516）腹腔注射进行常规麻醉；然后用生理盐水灌注，去除血液直至澄清；再立刻断头，小心取出3个脑组织，将脑组织根据所需部位，冠状切面修成0.5 cm厚的组织块。

1.3 固定本实验所采用的固定液、染色液和显色液均来自 Genmed的高尔基快速染色试剂盒。将修好的组织块立刻放入装有10 m L固定液 A和10 m L固定液 B的混合液离心管中，室温下避光浸泡、孵育2周。

1.4 制作方法（1）石蜡切片：将固定好的脑组织取出，用去离子水漂洗2次，放入装有 70%乙醇溶液的离心管中，依次梯度乙醇脱水，70%乙醇 24 h，80%乙醇溶液8 h，95%乙醇溶液Ⅰ6 h，95%乙醇溶液Ⅱ5 h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 h，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15 min透明［5］。用蜂蜡和石蜡以 1∶9比例的混合蜡浸蜡、包埋后用普通石蜡切片机冠状切片，切片厚度分别为20、40、60μm，漂片、摊片和烤片后，置于二甲苯脱蜡，梯度乙醇补水至去离子水，用滤纸吸干多余水分后，等待染色。（2）冷冻切片：2周后将组织块取出，用去离子水漂洗2次，放入装有30%的蔗糖溶液的离心管中，在4℃冰箱里浸泡孵育，直至组织块沉到离心管底，将组织取出。用去离子水稍加冲洗后，滴加包埋剂OTC适量于脑组织周围，待稍冷冻后进行冠状切片，切片厚度分别为60、80、100μm，将切好的脑片小心贴在事先挂好胶的明胶玻片上。将贴好的玻片用去离子水漂洗3次，每次5 min。用滤纸吸干多余水分后，等待染色。（3）振荡切片：将脑组织从固定液中取出，用去离子水漂洗2次后振荡切片，切片厚200μm，将切好的脑片收集在装有70%乙醇溶液的离心管中，用毛笔将所需部位的脑片捞出，小心贴在事先挂好胶的明胶玻片上，用滤纸吸干多余的70%乙醇溶液后，将贴好的玻片用去离子水漂洗3次，每次5 min。用滤纸吸干多余水分，等待染色。

1.5染色和封片在50 mL棕色滴瓶加入 10 mL去离子水，然后加入5 mL显色液 A和显色液 B，混匀，标记为显色工作液（有效期限 10天），然后进行以下操作，整个染色过程应避免光照：每块脑片小心滴加500μL显色工作液，铺满整个切片样本表面，室温下孵育30 min，小心用滤纸吸去切片上的染色液，将切片置入去离子水中孵育1 min，用滤纸吸去切片上的去离子水，每块脑片滴加500μL显色工作液，铺满整个切片样本表面，室温下孵育10～30 min，期间可在显微镜下观察，直至组织呈现黑色，即刻中止，避免光照。用滤纸吸去切片上的显色工作液，将切片置入去离子水中孵育1 min，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

在光学显微镜下观察三种制片方法各自的染色结果并拍照。（1）石蜡切片：厚度分别为20、40、60μm，神经元数量依次增加，背景干净呈淡黄色，神经细胞的胞体及树突、轴突皆呈黑色或黑红色。大鼠大脑皮质6层结构层次显示不够清晰，锥体细胞主树突显示逐渐完整，树突数量逐渐增多，轴突逐渐显现，可见星形胶质细胞（图1）。（2）冷冻切片：厚度分别为60、80、100μm，神经元数量依次增加，背景干净呈浅黄色，神经细胞的胞体及树突、轴突皆呈黑色或黑红色。大鼠大脑皮质6层结构逐渐清晰明显，锥体细胞主树突、树突和轴突逐渐显示完整，星形胶质细胞也渐渐显示完整（图2）。（3）振荡切片：厚度分别为200、1 000μm，神经元数量丰富，背景干净呈黄色，神经细胞的胞体及树突、轴突皆呈黑色或黑红色。大鼠大脑皮质6层结构清晰明显，锥体细胞主树突、树突和轴突显示完整，树突棘丰富，星形胶质细胞显示完整（图3）。

图1 石蜡切片不同厚度的放大效果：A.20 μm；B.40μm；C.60μm

图2 冷冻切片不同厚度的放大效果：A.20 μm；B.40μm；C.60μm

图3 振荡切片不同厚度的放大效果：A. 200μm；B.1 000μm

3 讨论

神经组织由神经细胞和神经胶质细胞组成，神经细胞也称为神经元［6］。大脑皮质的神经元都是多极神经元，根据细胞的形态可分为锥体细胞、颗粒细胞和梭形细胞三大类。（1）锥体细胞：数量较多，可分为大、中、小三型。胞体形似锥形，尖端发出一条较粗的顶树突，伸向皮质表面，沿途发出许多小分支，胞体还向四周发出一些水平走向的树突，轴突自胞体底部发出，长短不一，短的不超出所在的皮质，长的离开皮质进入白质，组成投射纤维和联合纤维。（2）梭形细胞：数量较少，大小不一，胞体为梭形，树突自胞体的上下两端发出，上端树突多伸达皮质表面。轴突从下端树突的主干发出，其终末分支可与锥体细胞形成突触。（3）颗粒细胞：数量最多，胞体较小，成颗粒状。它们的轴突通常较短，终止于附近的锥体细胞或梭形细胞［7］。

大脑皮质的神经元分布，除个别区域外，一般从表面至深层依次可分为6层。（1）分子层：神经元小而少，主要由水平细胞和星形细胞构成，还有许多与皮质表面平行的神经纤维；（2）外颗粒层：主要由许多星形细胞和少量小型锥体细胞构成；（3）外锥体细胞层：较厚，由许多中、小型锥体细胞和星形细胞组成；（4）内颗粒层：细胞排列紧密、多数是星形细胞；（5）内锥体细胞层：主要由中型和大型锥体细胞组成；（6）多形细胞层：以梭形细胞为主，还有锥体细胞和颗粒细胞［7］。

无论是进行科研试验还是制作典型的教学示教切片，观察大脑皮质的神经细胞及其突起、大脑皮质神经元的分层，我们最常用到高尔基染色法。近年来，高尔基染色法最常用的制作方法主要有石蜡［5，8］、冷冻［9］和振荡［10－11］。笔者对这三种方法进行比较，得出以下几点体会：（1）用振荡方法制作的切片，显示大鼠大脑皮质神经元的分层效果最好，层次清晰，神经元数量多，锥体细胞主树突、树突和轴突显示完整，树突棘丰富，星形胶质细胞显示完整，且1 000μm的切片比200μm的切片层次更清晰。（2）用石蜡方法制作的切片，背景最干净，但是受普通轮转切片机最大切片厚度60μm的限制，大鼠大脑皮质 6层结构层次不能清晰显示，锥体细胞的主树突、轴突及树突显示不完整，树突棘很难显示。星形胶质细胞显示不完整。（3）用冷冻方法制作的切片，与石蜡切片一样，受冷冻切片机最大切片厚度100μm的限制，大鼠大脑皮质6层结构层次清晰度介于石蜡切片和振荡切片之间，锥体细胞的主树突、轴突及树突显示较完整，树突棘稀疏；星形胶质细胞显示较完整。（4）石蜡切片和冷冻切片要经过脱水等过程，耗时较长，程序相对振荡，切片复杂，且不易切出完整的切片。（5）石蜡切片厚度经常出现裂片，本实验采用熔点在52～54℃的石蜡和熔点在54℃的蜂蜡以 9∶1的比例混合，浸蜡、包埋，以增加切片的润滑和粘滞性，切片刀和组织块的角度保持在10°以内，可减轻裂片的程度。大于10μm的石蜡切片切后易打卷，我们先把打卷的切片放在60℃温水上，切片会很快展开，接着捞出放入38℃温水上，待蜡片伸展平整后，用事先挂好胶的明胶玻片捞出，解决切片打卷后漂不开，浪费所需部位组织的问题。（6）冷冻切片也会经常出现裂片问题，把冻台温度控制在－17℃，箱内温度控制在 －20℃，且脑组织涂上包埋剂 OTC后，稍冻结后开始切片，能明显改善裂片的问题。（7）振荡切片由于组织较厚，为了背景更加清晰，高尔基染色后可以延长低浓度乙醇溶液的脱水时间，减少高浓度乙醇溶液的脱水时间，封片时由于切片较厚，需增加中性树胶的量才能将脑组织封固，并且能减少盖盖玻片时脑组织开裂。笔者认为振荡切片制作方法观察大鼠大脑皮质层次清晰，锥体细胞主树突、树突和轴突显示完整，树突棘丰富，星形胶质细胞显示完整，且操作简便，稳定性好，组织裂片率低，振动切片机属于特殊的切片机，价格贵，有些实验室不一定有振动切片机。

总而言之，高尔基染色法作为一种准确、可靠的神经组织染色，我们可以根据实验室现有条件，根据科研或者教学的需要选择不同的脑组织厚度，选择合适的切片制作方法。

［1］ Golgi C.Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello［J］.Gazz Med Lombardia，1873，6：244－246.

［2］ Cox W.Impragnation des centralen nervensystemsmit quecksilbersalzen［J］.Arch Mikr Anat，1891，37：16－21.

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［6］ 丁文龙，王祖承，陆钦池，等.神经、精神系统及感觉器官［M］.上海：上海交通大学出版社，2010：16.

［7］ 高英茂.组织学与胚胎学［M］.北京：高等教育出版社，2010：77.

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R 44

：B

1001－7399（2017）01－0113－03

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.032

接受日期：2016－10－31

徐州医学院2015年度院科研课题立项（2015Kj05）

1徐州医科大学基础医学院形态学实验教学中心、3遗传学教研室，徐州 221004

2东南大学医学院附属徐州中心医院神经内科，徐州221009

王 蕾，女，硕士，实验师。E-mail：wawa831214＠sina. com