制备小鼠支气管肺泡灌洗液方法的改进

张效云，辇晓峰，王文栋

制备小鼠支气管肺泡灌洗液方法的改进

张效云，辇晓峰，王文栋

支气管肺泡灌洗液；细胞计数；注射器

支气管肺泡灌洗术是一种通过对支气管肺泡灌洗技术，获取肺泡灌洗液进行免疫细胞、炎症因子和可溶性物质检查的方法，为某些呼吸道疾病的病情观察、诊断和预后判定提供新途径。医学科研工作者经常需要从小鼠动物模型制备支气管肺泡灌洗液，其制备方法非常重要，操作者需要有较好的技术，既要保证灌洗液一定的数量以完成较多细胞因子等测定，又要保证足够的细胞进行计数和分类。传统的方法［1］是在处死小鼠后，钝性剥离气管，用三通管连接注射器将磷酸盐缓冲液缓缓注入气管，轻轻按摩后取出液体，但有部分支气管灌洗液会从小鼠的口鼻中溢出，体积波动较大，结果不理想。经探索和实践，本实验使用结扎远心端气管并直接采用2 mL注射器制备支气管肺泡灌洗液，取得了良好的效果，并节约了费用，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物20只 C57BL／6雄性小鼠为健康清洁级，8周龄，体重（18±2）g，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号 SCXK-2012-0004。标记动物后，分笼颗粒饲料饲养，温度18～24℃，光暗周期 12 h，自由饮水进食。本实验符合河北北方学院实验动物伦理委员所制定的伦理学标准。

1.2 主要材料普通光学显微镜，小鼠固定操作台，2 mL注射器，直型静脉滞留针，三通管，磷酸盐缓冲液。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 实验小鼠随机分为改进组和传统组，每组各10只。

1.3.2 支气管肺泡灌洗液的制备及细胞计数 处死小鼠后，钝性剥离气管，传统组按传统方法制备支气管肺泡灌洗液，即将直型静脉滞留针插入气管，退出针芯，连接三通管和注射器装置轻轻插入气管，用2支2 mL注射器，其中1支取1 mL磷酸盐缓冲液，交替轻揉灌洗肺组织2次，轻轻按摩肺部，收获支气管肺泡灌洗液；改进组先将小鼠气管的远心端结扎，再将直型静脉滞留针插入气管，退出针芯，直接连接装有1 mL磷酸盐缓冲液的 2 mL注射器，轻揉灌洗肺组织 2次，轻轻按摩，收获支气管肺泡灌洗液。将两种方法获得的支气管肺泡灌洗液 1 400 r／s离心 10 min，分离上清液准确测定体积。用100μL磷酸盐缓冲液重悬沉淀，充入计数池在高倍显微镜下计数除上皮细胞及红细胞外所有细胞（巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞等）的总数，以每毫升回收液的细胞数和灌洗液回收细胞的总数表示。

1.4 统计学方法所有数据采用 SPSS 19.0软件进行统计学分析，结果以±s表示，采用独立样本 t检验进行两组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠支气管肺泡灌洗液体积比较改进组小鼠获取的支气管肺泡灌洗液平均体积约为传统组的 1.62倍，体积明显增加，差异有显著性（P＜0.01，表1）。

表1 两组小鼠支气管肺泡灌洗液体积比较

2.2 两组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数的变化计数改进组和传统组支气管肺泡灌洗液中除上皮细胞及红细胞外的所有细胞（巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞等）总数结果显示，两组每毫升细胞总数差异无显著性（P＞0.05），但改进组灌洗液回收细胞总数明显多于传统组，差异有显著性（P ＜0.01，表2，图1、2）。

图1 传统方法制备支气管肺泡灌洗液

图2 改进方法制备支气管肺泡灌洗液

表2 两组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数比较

3 讨论

支气管肺泡灌洗检测作为一种分析手段，其上清液、细胞计数及进一步的分类可为肺部病变性质、炎症过程及疾病活动性等提供重要的参考信息［2］，并为分析肺疾病的发病机制、诊断指征提供重要的依据，故获取高质量支气管肺泡灌洗液非常重要。

本方法与传统制备小鼠支气管肺泡灌洗液有两点不同：（1）将气管远心端结扎后实施灌洗，能回收＞89%的灌洗液，大大提高实验成功率，避免传统方法在灌洗液的抽取过程中，部分或大量液体随气管进入小鼠口鼻而流到体外，造成支气管灌洗液的浪费，且传统方法获取灌洗液的体积有多、有少，多可达0.8 m L，少则0.1或0.2 mL，不能满足所有样本多个细胞因子等测定的需求。虽然两种方法每毫升灌洗液的细胞总数差别不大，但总灌洗液细胞数目偏少，造成计数及分类不准，影响实验结果的准确性。（2）直接采用 1 支2 m L注射器而非传统制备方法使用的三通管及 2支 2 mL注射器插入气管，简化了步骤，节约了费用，尤其批量操作既节约时间，又降低成本。

操作过程中还应注意一些问题：（1）结扎不要太过用力，以免切断气管，但又不可太松，以免少量灌洗液流入鼻腔，造成浪费；（2）用直型静脉滞留针，要适当深入气管，以免退出针芯后带出套管。

总之，改进后的小鼠支气管肺泡灌洗液制备方法有助于对小鼠肺疾病模型的更好分析，使每只小鼠支气管肺泡灌洗液的制备量均能达最大体积，避免灌洗液的浪费，最大限度地满足实验需求，对灌洗液细胞计数和分类更加准确，提高实验的成功率。

［1］ 张效云，李 琦，张颖骞.中和白细胞介素-17加重小鼠衣原体呼吸道感染［J］.北京大学学报（医学版），2013，45（4）：613－618.

［2］ 徐 佳，黄 媛，吴 卫，等.改良支气管肺泡灌洗液细胞分类计数制片及染色法［J］.临床检验杂志，2014，32（2）：98－101.

R 332

：B

1001－7399（2017）01－0109－02

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.030

接受日期：2016－11－30

张家口市科技局自然科学基金资助（12110046D-1）

河北省张家口市河北北方学院医学检验学院生化教研室075000

张效云，女，硕士，教授。Tel：（0313）4029270，E-mail：xyzonly928＠163.com