谷甾醇对斑马鱼生长发育和生殖的影响

冯子懿，侯丽萍，郑 果，梁艺聪，何骏驹

（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）

谷甾醇对斑马鱼生长发育和生殖的影响

冯子懿，侯丽萍，郑 果，梁艺聪，何骏驹

（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）

为了研究谷甾醇（sitosterol）暴露对斑马鱼（Barchydanio rerio var）内分泌的干扰效应，通过不同浓度的谷甾醇（50、100、150、200 μg/L）对雌性斑马鱼进行为期60 d的水浴暴露，同时设乙醇对照，分别于60 d后测定各组分雌性斑马鱼的生长指标，对部分组织进行切片观察，从组织病理学和毒理学方面评估谷甾醇暴露的毒性效应。结果表明：在200 μg/L谷甾醇暴露下，斑马鱼全部死亡，其他各浓度处理与对照组相比，除臀鳍数随谷甾醇浓度的增加呈现倒“U”型趋势，以及肝重随谷甾醇浓度的增加而上升外，其他各生长指标均不同程度受到抑制，抑制作用与暴露浓度呈明显的剂量效应。此外，性腺指数（GSI）呈下降趋势，肝体指数（HSI）呈上升趋势，各组织切片也表现出明显的毒性反应。因此，可初步判断谷甾醇对斑马鱼的生长发育和繁殖系统会产生较大影响。

谷甾醇；斑马鱼；暴露；生长繁殖

内分泌干扰物（Endocrine disruptors chemicals，EDCs）是指能够干扰体内天然激素合成、分泌、传输、键合或清除的激素类似物，在环境中含量很低。谷甾醇（sitosterol）是植物雌激素（Phytoestrogen，PE）类中一种最常见的内分泌干扰物，由于在牛皮纸或纸浆中的漂白污水中广泛检出而受到人们的关注[1]。研究表明，多种鱼类的发育异常与污水中的环境雌激素有关。环境中的雌激素通过生物富集作用，造成鱼类生长发育迟缓、生殖器和性腺形态功能异常等。其中，β-谷甾醇对血液中卵黄蛋白原水平、性别分化以及肝细胞病变程度均具有明显干扰效应，可使成熟精母细胞和精子的比例失衡[2-5]。

斑马鱼（Barchydanio rerio var）是辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤形目（Cypriniformes）鲤形科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼。斑马鱼是环境毒理学中常用的标准生物模式种，其基因的保守性与人类基因组相比约为87%[6]，具备雌雄易分辨、易存活、有类似人类的器官系统等优点，被广泛应用于遗传学、环境毒理学及医学领域。

活体鱼类测试内分泌干扰效应的敏感指标包括肝体指数（Hepatosomatic index，HSI）、性腺指数（Gonadosomatic index，GSI）和性腺组织结构等[7]。研究以雌性斑马鱼为研究对象，从形态学、生理学各指标以及毒理学组织切片等方面来评估谷甾醇对雌性斑马鱼内分泌系统和生殖系统的毒性效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取国际热点模式动物红斑马鱼为试验动物，购买于广州市翠竹苑花鸟鱼市场，体长均在4～5 cm，体重为0.7～0.9 g。挑选雌性斑马鱼单独饲养，待生长情况稳定后，开始暴露试验。

供试谷甾醇（sitosterol），以乙醇（70%）为助溶剂，配制成1 g/L的母液，稀释到相应浓度，4℃避光保存，待用。

试验用水为充分曝气的自来水，饵料为商业购买的红虫。监测水质用Thermo多道水质监测仪（Thermo Orion，520M-01，广州）。

1.2 暴露处理

暴露容器为25 cm×20 cm×20 cm 的方形玻璃缸，正式暴露试验前，使鱼群处于试验环境条件下，直至雌斑马鱼持续保持零死亡率。挑选大小基本相同的雌斑马鱼180尾，每组试验鱼30尾，谷甾醇溶液暴露浓度分别为50、100、150、200 μg/L，另以等体积乙醇作对照，共5个处理。用15 L的水进行养殖，暴露周期持续60 d。每个处理设3个平行组，采用半静态暴露装置，试验期间将水温保持在25℃左右，用充气机供氧，调节充气量以保证不同浓度废水中的溶解氧含量一致，溶解氧大于4 mg/L，pH值在6～8之间。每日早晨、中午、晚上各喂食1次，2 d换1次水并清理排泄物，每次换总体积的1/3，若水质出现异常波动，则立即换水[8]。光周期为12 h光照12 h黑暗。

1.3 测定指标及方法从形态学观测记录斑马鱼各生长指标，从毒理学方面观测各组织切片中细胞和结构的变化。

1.3.1 形态学和生理学测定 暴露结束后，将斑马鱼埋入冰中致死。从低浓度开始测量观察，测量每条斑马鱼的体长、体重和臀鳍数。对斑马鱼进行解剖，迅速取出鱼肝、鱼鳃及性腺，用滤纸吸取血渍，称重记录。

1.3.2 组织切片制作 配置Bouin氏液：称取2.25 g苦味酸固体溶解于150 mL蒸馏水中，福尔马林50 mL，冰醋酸10 mL，搅拌均匀。用Bouin氏液迅速固定称重之后的鱼肝、鱼鳃及性腺，封盖并贴标签。用浓度梯度递增的乙醇溶液脱水，至100%乙醇，使脱水硬化，选用二甲苯（xylene）为透明剂。用石蜡作为支持介质并对组织进行石蜡包埋，用切片机切片后，采用苏木素伊红染色法（EH染色法）进行染色，后用树胶和盖玻片封固。

1.3.3 肝体指数（HSI）和性体指数（GSI） HIS=肝重/体重，GSI=性腺重/体重

1.4 数据分析

试验所得的数据均用SPSS 17.0软件进行分析，采用单因素方差分析（ ANOVA） 法来检验不同处理下斑马鱼各生理指标的差异，并用LSD对结果进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 水体中谷甾醇暴露对雌斑马鱼形态生理特征的影响

2.1.1 体 长 由图1可知，在100 μg/L谷甾醇处理下，雌斑马鱼体长就受到显著抑制，而当谷甾醇浓度增加至150和200 μg/L时，雌斑马鱼的体长极显著短于对照；50 μg/L谷甾醇处理的雌斑马鱼体长稍长于对照，但差异不显著。

图1 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼体长的影响

2.1.2 体 重 由图2可知，随着谷甾醇浓度的增加，雌斑马鱼的体重呈下降趋势，各处理间差异均达显著水平。

图2 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼体重的影响

2.1.3 臀鳍数 由图3可知，在谷甾醇暴露下，各处理雌斑马鱼臀鳍数呈现先上升后下降的趋势（倒“U”型趋势），在100 μg/L谷甾醇处理下，雌性斑马鱼臀鳍数最多，而150和200 μg/L谷甾醇处理的雌斑马鱼臀鳍数与对照组相比则显著下降。

图3 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼臀鳍数的影响

2.1.4 鳃 重 由图4可知，随着谷甾醇浓度的增加，雌斑马鱼的鳃重随之减少，具有明显的剂量效应。在200 μg/L谷甾醇处理下，雌斑马鱼的平均鱼鳃重下降至对照组的60.2%，差异达极显著水平。

2.1.5 肝 重 由图5可知，随着谷甾醇浓度的增加，雌斑马鱼的肝重随之增加，且150和200 μg/L谷甾醇处理的雌斑马鱼肝重量分别比对照增加39.6%和61.7%，且差异分别达显著和极显著水平。

图4 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼腮重的影响

图5 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼肝重的影响

2.1.6 性腺重 由图6可知，随着谷甾醇浓度的增加，雌斑马鱼性腺重量随之下降，且下降趋势越来越明显，具有明显的剂量效应。150和200 μg/L谷甾醇处理的雌斑马鱼性腺重量分别比对照降低25.8%和61.7%，且差异分别达显著和极显著水平。

图6 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼性腺重的影响

2.2 水体中谷甾醇暴露对雌斑马鱼生长与生殖相互关系的影响

由试验数据分析可得：体长指标与体重、鳃重和肝重在0.01水平上极显著相关，与性腺重在0.05水平上显著相关；体重指标与臀鳍数在0.05水平上显著相关，与其他指标在0.01水平上极显著相关；臀鳍数指标与性腺重在0.01水平上极显著相关，与体重、鳃重和肝重在0.05水平上显著相关；鳃重指标与体长、体重和肝重在0.01水平上极显著相关，与臀鳍数和性腺重在0.05水平上显著相关；肝重指标与体长、体重和鳃重在0.01水平上极显著相关，与臀鳍数和性腺重在0.05水平上显著相关；性腺重与体重和臀鳍数在0.01水平上极显著相关，与其他指标在0.05水平上显著相关。由此可得到，体重与肝重及性腺重有明显的相关性，进而可分析其肝体指数（HSI）和生殖腺指数（GSI）。

图7显示了不同浓度谷甾醇暴露对雌斑马鱼肝体指数（HSI）的影响。与对照组相比，50 μg/L谷甾醇处理下雌斑马鱼的HSI略微降低，当谷甾醇浓度增加至100 μg/L及以上时，雌斑马鱼肝体指数有所上升，其中在200 μg/L谷甾醇处理下，雌斑马鱼的肝体指数较对照组增加了127.3%。总体上谷甾醇的暴露对雌斑马鱼的肝体指数有明显的上升诱导作用。

图7 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼HSI的影响

图8显示了不同浓度谷甾醇暴露对雌斑马鱼生殖腺指数（GSI）的影响。与对照组相比，随谷甾醇浓度的增加，雌斑马鱼的性腺指数呈下降趋势，且在200 μg/L谷甾醇处理下，GSI下降率达60.2%。总体上谷甾醇的暴露对雌斑马鱼的生殖腺指数有明显的下降诱导作用。

图8 不同浓度谷甾醇暴露60 d对雌斑马鱼GSI的影响

2.3 水体中谷甾醇暴露对雌斑马鱼各组织结构的影响

2.3.1 鳃 从图9可看出，对照组雌斑马鱼鳃组织中细胞大小相近，分布整齐均匀，而在谷甾醇暴露下的各处理鳃组织细胞开始出现退化、长短不一，不规则现象，200 μg/L谷甾醇处理下鳃组织已经严重扭曲发生破裂现象。

2.3.2 肝 由图10可知，对照组肝细胞排列紧密，结构清晰，大小一致，细胞核明显；而谷甾醇处理下的试验组肝细胞开始裂解、扭曲、分散，几乎看不到细胞核，细胞空泡化，成絮状。随着谷甾醇的浓度增加，肝细胞的损坏程度更加严重。

图9 不同浓度谷甾醇暴露60 d后雌斑马鱼鳃组织的变化

图10 不同浓度谷甾醇暴露60 d后雌斑马鱼肝组织的变化

2.3.3 性 腺 如图11所示，对照组雌斑马鱼的卵细胞均比较完整，含有I期卵原细胞时相、II时期初级卵母细胞、III时期卵黄泡出现时期、IV期卵黄充满时期、V期成熟卵细胞时期，VI期退化吸收时期（图11A和B）；试验组与对照组相比，几乎没有成熟卵细胞，细胞分化开始受抑制，图11D中卵黄充满时期的卵细胞开始裂解，表现出毒性反应；图11E中卵细胞严重裂解，细胞严重退化，毒理效应十分明显。

3 结论与讨论

3.1 谷甾醇暴露对雌斑马鱼形态生理特征的影响

试验结果显示，在200 μg/L谷甾醇暴露下，斑马鱼全部死亡，随谷甾醇暴露浓度的增加，雌斑马鱼的体长和体重均呈下降趋势，且均具有显著性影响，说明这两个指标可作为水质监测的形态学指标；对臀鳍数的影响则表现出谷甾醇具雌激素效应和抗雌激素效应的双重效应。

研究表明，植物雌激素可能通过雌激素受体介导途径或者非受体介导途径发挥雌激素效应或抗雌激素效应的双重效应，引发相应的反应级联，干扰鱼体内性激素的合成、分泌与代谢，进一步导致性别分化、性腺发育、等的紊乱。Aldercreutz等[9]通过试验证实这种双重效应可能是由植物雌激素与内源雌激素的比例决定的。

图11 不同浓度谷甾醇暴露60 d后雌斑马鱼卵巢组织的变化

鳃是鱼类特有的器官，也是鱼类重要的呼吸器官，是鱼类与水体接触的第一系统，因此极易受到水环境中有毒物质的影响，鳃重的下降反映出谷甾醇对斑马鱼的毒性效应。

肝脏是鱼类重要的腺体，与物质代谢有紧密的关系，外源物质进入鱼体后主要在肝脏中进行分泌和代谢。因此，肝脏是环境监测和毒理学研究的重要器官。试验结果显示，雌斑马鱼的肝重随谷甾醇浓度的增加而增加，这可能是由于毒物的累积效应影响了鱼体的正常代谢导致的。

性腺是毒理学研究中的重要器官，与性别分化有关，雌性斑马鱼的卵巢重量在谷甾醇暴露下呈现出下降趋势，这说明谷甾醇对性腺具有干扰效应。以上均说明谷甾醇会对鱼类的生长发育产生干扰，组织器官和繁殖系统也会受到影响。

3.2 谷甾醇暴露对雌斑马鱼生长和生殖相互关系的影响

鱼类的生长包括营养生长和生殖生长，HSI和GSI的变化可以反映出生长与生殖的相互关系，也反映了卵黄的发生和积累过程。鱼类卵黄的发生主要通过两种形式：一是由卵母细胞自身合成，称为内源性卵黄合成或自动合成；二是自卵母细胞以外的地方合成，然后进入卵母细胞，称为外源性卵黄合成[10-11]。外源性卵黄的形成是在雌激素作用下，肝细胞中首先合成卵黄前体物质（卵黄蛋白原），然后经血液循环输送到卵巢，再通过微胞饮作用被卵母细胞吸收，最终在卵母细胞中裂解为卵黄担保，称为卵母细胞发育与成熟的物质基础[12]。因而，由图7和图8可明显看出，HSI与GSI变化趋势相反，肝体指数不断增加，生殖腺指数不断下降。这说明在低浓度谷甾醇溶液处理下，肝细胞仍发挥其合成卵黄前体物质的作用并向卵巢输送，随谷甾醇浓度的增大，雌斑马鱼卵巢的生理功能受到抑制而无法吸收或无法分解卵黄蛋白原，或卵黄蛋白原的输送受到抑制，而使肝内合成的卵黄蛋白原大量积累，肝内贮存的能量物质无法转化为性产物，因而HSI明显上升。端正花等[6]的研究表明，低剂量外源化合物会导致肝脏尺寸膨大，肝组织发生炎症从而充血、水肿，高剂量下会导致肝脏尺寸减小，具有抑制肝脏发育和肝脏细胞损伤毒性，从这方面可判断出谷甾醇对营养生长的毒性相对较弱。综上所述，在谷甾醇作用下，雌斑马鱼的肝体指数与生殖腺指数具有此增彼减的效应，生殖生长受到明显抑制，对营养生长的毒性较小。

3.3 谷甾醇暴露对雌斑马鱼各组织结构的影响

张凤君等[13]试验观察显示，暴露在50 μg/L 多氯联苯（PCBs，一种油状化学物质）水中，试验斑马鱼鳃的结构和功能呈显著受损伤状态。鱼鳃与水体直接接触，直接暴露于毒物下，鱼鳃的损坏会影响鱼体整个呼吸系统的正常功能，严重时导致鱼体死亡。

甘海燕等[5]发现随着污水浓度的增大以及污染时间的延长，肝细胞病变程度加重，肝窦隙扩张，细胞核肿大甚至裂解消失，胞质疏松，空泡明显增加。由此表明，内分泌干扰物谷甾醇对雌斑马鱼肝脏有毒害作用。

促性腺激素释放激素（GnRH）是由下丘脑分泌，刺激或抑制垂体促性腺激素的分泌，具有相当的活性潜能。正常生存的鱼类通过下丘脑分泌GnRH，刺激促性腺激素的分泌，然后促性腺激素促进雌激素的分泌，从而促进性腺发育。该试验中雌斑马鱼的性腺发育受到明显抑制，表明雌激素的分泌或者与性腺发育有关的激素分泌也会受到抑制，进而阻碍雌激素的正常分泌，影响性腺发育[14]。

综上所述，雌斑马鱼经不同浓度谷甾醇暴露60 d后，其体长、体重、鳃重和性腺重均有明显的抑制效应，肝重量则随谷甾醇浓度增加而增加；臀鳍数倒“U”的趋势变化反应了谷甾醇作为雌激素的双重效应，即在内源性雌激素水平较低时，低浓度谷甾醇可充当雌激素促效剂，而高浓度谷甾醇则会竞争性与雌激素受体结合而减弱雌激素对靶细胞的应答，表现为拮抗作用。这些生理指标均可作为评估谷甾醇毒性效应的参考指标。在试验组谷甾醇的暴露下，雌斑马鱼表现为HSI上升，GSI下降，且HSI和GSI表现出此增彼涨的趋势，说明肝脏与雌斑马鱼的卵巢间存在着某种紧密的联系，可能与卵黄蛋白原的输送和吸收有关，仍有较大的研究空间。从各组织切片图可直观看到谷甾醇对各组织的损伤及影响情况，组织受损伤程度亦可成为评估谷甾醇毒性大小的直观指标。

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（责任编辑：成 平）

Effects of Sitosterol on the Growth and Reproduction of Barchydanio rerio var

FENG Zi-yi，HOU Li-ping，ZHENG Guo，LIANG Yi-cong，HE Jun-ju
（School of life science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, PRC）

The effect of sitosterol on physiological indexes, HSI and GSI in the liver of Barchydanio rerio var were investigated. The female were selected and exposed to 50, 100, 150 μg/L and 200 μg/L sitosterol for 60 d by using the hydrostatic bath method. The results showed that except for all death of the Barchydanio rerio var in the solution under concentration of 200 μg/L, there was dose effect relationship between physiological indexes and sitosterol concentration within a certain concentration range. The paper also indicated that GSI presents a trend of increasing and the HSI presents opposite, and obvious toxic effects were presented in the tissue section figures. It is concluded that sitosterol effects the growth and reproductive system of Barchydanio rerio var.

sitosterol; Barchydanio rerio var; exposure; growth and reproduction

S949

：A

：1006-060X（2017）02-0074-06

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.020

2016-08-11

广东省海洋生物技术重点试验室开放基金（GPKLMB201603）

冯子懿（1994-），女，河南安阳市人，本科生，专业：生态毒理。

侯丽萍