雷帕霉素对雄性小鼠生殖能力的影响及相关机制探讨

谢 婕

(南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166)

不孕不育症是影响人类生殖繁衍的主要疾病。在全球，有近15%的育龄夫妻受到此病的影响。在不孕不育症患者中，女性不孕症患者和男性不育症患者各占50%[1]。不育症主要是由男性体内激素分泌紊乱、染色体突变、DNA受损或罹患代谢疾病等引起其精子的发生过程异常所致[2]。精子的发生过程受到多重严密基因/蛋白网络的调控，mTOR信号通路等相关的信号通路在其中发挥着重要的作用。mTOR信号通路由mTORC1和mTORC2两种复合体组成，Raptor和Rictor分别是这两种复合体中的特异蛋白。mTOR信号通路最早被证实在细胞增殖、细胞骨架形成、糖脂代谢方面发挥着重要的作用。将小鼠体内的Raptor和Rictor基因进行全身性敲除会导致其在胚胎期死亡。因此，mTOR信号通路与小鼠的胚胎发育有关。雷帕霉素（Rapamycin）是mTOR信号通路的重要抑制剂，能够与mTOR蛋白直接结合，抑制其信号通路的功能。在临床上，雷帕霉素曾被广泛用于进行肾脏移植和癌症的治疗中，但男性患者在用药的过程中可发生不育症，其表现为不同程度的少精甚至无精[3]。本研究主要探讨雷帕霉素造成雄性小鼠不育的原因，并分析雷帕霉素引发的雄性小鼠不育症与mTOR信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及喂食方案

本次实验中的29只SPF级B6雄性小鼠由南京医科大学动物中心提供，其中包括3.5 d的小鼠8只，10 d的小鼠4只，14 d的小鼠2只，21 d的小鼠2只，8 w的成年小鼠13只。将其中各日龄的小鼠用于检测不同日龄小鼠睾丸mTOR/Raptor/Rictor基因（蛋白）表达的水平，将其中12只8 w的小鼠用于构建喂食组小鼠模型（分为对照组小鼠6只与喂食组小鼠6只）。将雷帕霉素（14 ppm）添加入小鼠的饲料中。采用2.25 mg/kg的剂量体重比为喂食组小鼠喂食该饲料4周。为对照组小鼠喂食正常的饲料。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠睾丸蛋白的提取及检测 取4只3.5 d、2只10 d、1只14 d、1只21 d、1只8 w的成年小鼠、喂食4周后的对照组成年小鼠和喂食组成年小鼠各3只（对照组和喂食组小鼠附睾用于后续精子活力检测实验），用脊椎脱臼法将其处死，打开其腹腔，取其两侧的睾丸用1ml的RIPA裂解液（南京诺维赞公司提供）进行研磨裂解，以12500 rpm的转速进行高速离心操作后取上清液，取2 μl的上清蛋白用BCA蛋白浓度检测试剂盒（南京诺维赞公司提供）进行浓度检测，用10%的SDS胶进行蛋白电泳，需要检测的抗体包括mTOR/Raptor/Rictor/p-S6/p-S473-AKT/p-T308-AKT抗体（CST公司提供）、β-Actin抗体（Sigma公司提供）。

1.2.2 小鼠睾丸总RNA提取及mRNA表达检测 取4只3.5 d、2只10 d、1只14 d、1只21 d、1只8 w的成年小鼠，采用脊椎脱臼法将其处死，打开其腹腔，取其两侧的睾丸用1ml的Trizol（Invitrogen公司提供）进行研磨裂解，以12500 rpm的转速进行高速离心操作后取上清液，在上清液中加入200 μl的氯仿，混匀后以12500 rpm的转速进行高速离心操作后取最上层液体，在最上层液体中加入500 μl的异丙醇混匀，以12500 rpm的转速进行高速离心操作后倒掉上清液、保留沉淀。用75%的乙醇清洗沉淀，以7500 rpm的转速进行离心操作，倒掉乙醇，晾干沉淀，加水溶解RNA样品，用总RNA提取试剂盒（Invitrogen公司提供）逆转录成cDNA。将cDNA样品用SYBR green试剂盒（TAKARA公司提供）进行荧光定量PCR检测，以36B4作为内参基因。

1.2.3 引物合成 本实验中所用的引物均合成于上海生工生物工程公司，引物序列为：mTOR序列（Forward:5’-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3’；Reverse:5’-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3’）。Rictor序 列（Forward:5’-TGTGGCCAAATTACAAGGAG-3’；Reverse:5’-TCTCCACCTCATTGCTCTG-3’）。Raptor 序列（Forward:5’-TTTGTCTACGACTGTTCCAATGC-3’；Reverse:5’-GCTACCTCTAGTTCCTGCTCC-3’）。36B4序 列（Forward:5’-GCAGATCGGGTACCCAACTGTTG-3’Reverse：:5’-CAGCAGCCGCAAATGCAGATG-3‘）。

1.2.4 小鼠睾丸和附睾HE切片制备及染色 取喂食4 周后的对照组成年小鼠和喂食组成年小鼠各3只，用脊椎脱臼法将其处死，打开其腹腔，取新鲜的小鼠睾丸和附睾于Bouin固定液（Sigma公司提供）中固定48 h。将固定后的组织放入包埋框脱水，在脱水后进行石蜡包埋，包埋完成后进行切片。将此组织切片放入65℃的烘箱中过夜脱蜡，用苏木精-伊红（Sigma公司提供）染色法进行染色，用中性树脂封片剂封片，在37℃的烘箱过夜。

1.2.5 精子活力检测 取喂食4周后的对照组成年小鼠和喂食组成年小鼠各3只，用脊椎脱臼法将其处死，打开其腹腔，取出其附睾，放入PBS缓冲液中轻柔地剪碎附睾，将样品置于37℃水浴箱中进行温育，取10 μl含有精子的PBS混合液用CASA检测仪进行检测。

1.3 观察指标

采用Western blot结合RT-PCR法检测mTOR信号通路重要组分蛋白在不同日龄的小鼠睾丸中表达的水平。采用睾丸和附睾HE染色法观察两组小鼠睾丸的大小、生精细胞的发育状况及附睾内精子的数目。采用CASA检测仪检测察两组小鼠成熟精子的活力。采用western blot法检测对照组和喂食组小鼠睾丸组织中mTOR通路重要组分蛋白表达的水平。

1.4 统计学处理

每个实验设计3组生物学重复样品。采用SPSS20.0统计软件对本研究中的数据进行分析，计量资料用（2±s）表示，采用t检验，计数资料用%表示，采用χ 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mTOR信号通路重要组分基因（蛋白）在不同日龄小鼠睾丸中的表达水平

对mTOR/Raptor/Rictor在不同日龄小鼠睾丸中表达的水平进行检测的结果显示，mTOR和Raptor在21 d的小鼠睾丸中呈高表达，Rictor在14 d的小鼠睾丸中呈高表达。详见图1。粗线期精母细胞在小鼠出生后的第14 d开始在其体内产生，在其出生后的21 d在睾丸生精细胞中占比最高。mTOR信号通路重要组分基因（蛋白）的表达可能与小鼠睾丸组织中粗线期精母细胞的发育有关。

图1 mTOR信号通路重要组分基因（蛋白）在不同日龄小鼠睾丸中表达的水平：（A-C）mTOR/

2.2 对照组和喂食组小鼠生殖表型的观察

对照组小鼠的体重为（22.83±0.67）g，其睾丸的重量为（85.58±9.03）mg。喂食组小鼠的体重为（23.32±0.74）g，其睾丸的重量为（38.19±5.12）mg。与对照组小鼠相比，喂食组小鼠的睾丸重量减小（t=7.907，P=0.001）。与对照组小鼠相比，喂食组小鼠的精子活力较弱，其精子中快速、中速及慢速运动精子的占比较低，其精子中不运动精子的占比较高（P＜0.05）。详见图2B 。HE染色的结果显示，与对照组小鼠相比，喂食组小鼠睾丸中各级生精细胞的排布较混乱（图2C-D），其附睾中精子的细胞数量较少（部分管腔呈空泡状态）。详见图2E-F。

图2 对照组和喂食组小鼠生殖表型的比较：（A）其睾丸大小的比较。（B）其精子活力的比较。（C-D）其睾丸HE染色结果的分析。（E-F）其附睾HE染色结果的分析。

2.3 对照组和喂食组小鼠mTOR通路重要蛋白表达水平的比较

与对照组小鼠相比，喂食组小鼠睾丸组织中mTOR信号通路重要组分蛋白Raptor/Rictor表达的水平下降，下游直接作用蛋白p-S6、p-S473-AKT、p-T308-AKT表达的水平也下降。详见图3。喂食组小鼠睾丸组织中mTOR信号通路直接作用蛋白表达水平的显著下降，提示其mTOR信号通路受到破坏。

图3 用Western blot检测对照组和喂食组小鼠mTOR通路重要蛋白表达的水平。

3 讨论

雷帕霉素是一种免疫抑制剂，具有促进细胞自噬、增强干细胞的功能、抑制癌症的发生等作用，在临床上曾被广泛用于进行肾脏移植和癌症治疗的过程中。在使用雷帕霉素对男性患者进行治疗时，会导致部分患者出现少精和弱精症，但其致病机制尚未完全阐明。

既往的研究结果表明，mTOR信号通路在细胞的增殖、分化、细胞骨架的形成中均发挥着重要的作用[4-5]，且越来越多的研究证实mTOR信号通路与小鼠睾丸生殖细胞的发育相关。mTOR信号通路上游抑制因子的表达能够提高精原干细胞自我更新的能力[6]。mTORC1复合体核心组分Raptor与原始生殖细胞的增殖能力相关[7]。将Raptor条件性敲除后动物体内精母细胞减数分裂的过程可受到阻滞[8]。

研究发现，雷帕霉素分子能够与mTOR蛋白直接结合，进而可抑制mTOR信号通路的功能。本研究通过给小鼠喂食雷帕霉素，观察此药对小鼠生殖能力的影响，结果显示，雷帕霉素可作用于mTOR信号通路，进而影响小鼠睾丸和附睾的生理结构和功能，使其出现睾丸重量减小、睾丸曲细精管内部各级生精细胞排列混乱、附睾中精子细胞的数目减少、成熟精子活力降低等情况。此外，mTOR信号通路重要蛋白mTOR/Raptor/Rictor主要表达于粗线期精母细胞中。上述结果证实，免疫抑制剂雷帕霉素可通过抑制mTOR信号通路的功能导致小鼠生殖能力异常，其作用与睾丸组织粗线期精母细胞功能异常相关。

综上所述，雷帕霉素能够导致雄性小鼠睾丸和附睾的结构异常，影响其睾丸中成熟精子的生成。雷帕霉素可通过影响mTOR信号通路的功能干扰雄性小鼠精子发生的过程。

[1]李惠,张建芳,王海燕,等.人类精液中的抗氧化防御系统[J].中国计划生育学杂志,2016,24(12):850-854.

[2]郭平.内分泌失调性不孕不育的原因及防治对策[J].当代医学,2016,22(9):158-159.

[3]王贺,肖晓素,纪玲.9 号染色体臂间倒位与不孕不育相关性的探讨[J].中国优生与遗传杂志,2017,25(3):47-48.

[4]Blenis J.TOR,the Gateway to Cellular Metabolism,Cell Growt h,and Disease[J].Cell,2017,171(1):10-13.

[5]白艳梅,刘海杰,高微,等.mTOR在炎性自身免疫性疾病中的作用[J].中国免疫学杂志,2017,33(2):301-304.

[6]曾慧红,朱清仙,匡渤海,等.造血干细胞老化与mTOR信号通路[J].中国细胞生物学学报,2017,39(6):017.

[7]Wang M,Guo Y,Wang M,et al.The Glial Cell-Derived Neurotrop hic Factor (GDNF)-responsive Phosphoprotein Landscape Identif ies Raptor Phosphorylation Required for Spermatogonial Proge nitor Cell Proliferation[J].Molecular & Cellular Proteomics,2017,16(6):982-997.

[8]Xiong M,Zhu Z,Tian S,et al.Conditional ablation of Raptor in the male germ line causes infertility due to meiotic arre st and impaired inactivation of sex chromosomes[J].The FASEB Journal,2017,31(9):3934-3949.