CYP2W1在胃癌中的表达及其生物学功能研究

刘东升，黄天臣

（1.河南护理职业学院，河南 安阳 455000；2.安阳市肿瘤医院，河南 安阳 455000）

CYP2W1在胃癌中的表达及其生物学功能研究

刘东升1，黄天臣2

（1.河南护理职业学院，河南 安阳 455000；2.安阳市肿瘤医院，河南 安阳 455000）

目的 探讨CYP2W1在胃癌组织中的表达情况，研究其生物学功能。方法 采用免疫组化法检测326例胃腺癌组织及326例正常胃黏膜组织中CYP2W1蛋白的表达情况；采用Western blotting实验随机检测10例胃腺癌组织和10例正常胃黏膜组织中CYP2W1蛋白的表达情况；建立4组胃癌组织、1组正常胃黏膜组织细胞系，应用实时荧光定量PCR检测各组细胞系中CYP2W1 mRNA的表达量；通过平板克隆、划痕愈合实验研究其对胃癌细胞增殖和迁徙侵袭能力的影响。结果胃癌组织中，CYP2W1蛋白表达明显高于正常胃黏膜组织（P＜0.05）。胃癌细胞中CYP2W1 mRNA的表达量明显高于正常胃黏膜细胞（P＜0.05）。CYP2W1阳性胃癌细胞的克隆形成数量明显高于正常胃黏膜细胞（P＜0.05）。24 h/48 h CYP2W1阳性胃癌细胞划痕修复速率明显高于正常胃黏膜细胞，CYP2W1阳性胃癌细胞划痕愈合面积明显大于正常胃黏膜细胞，二者比较差异有显著性（P＜0.05）。结论 CYP2W1仅在胃癌组织中表达，在正常胃黏膜组织中不表达；CYP2W1与胃癌细胞的生长增殖及迁徙侵袭能力明显相关。

胃癌；CYP2W1；增殖；侵袭

胃癌（gastric cancer，GC）为消化道肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤。关于胃癌发生浸润和转移的基因及分子标记物的研究对胃癌的早期诊断、治疗、预后评估具有重要的临床意义。CYP2W1为细胞色素P450超家族的新成员之一，具有肿瘤特异性。关于胃癌中CYP2W1的表达及其与胃癌增殖及侵袭能力关系的研究，迄今尚未见国内外报道。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源

收集2010年3月至2015年3月于安阳市肿瘤医院接受胃癌根治术治疗的326例胃癌患者的手术标本，以多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，分别用于HE染色及免疫组织化学染色。新鲜标本保存于液氮中，用于Western blot实验。正常胃黏膜组织：取自距癌组织边缘5 cm以上的手术标本，经病理学证实为正常胃黏膜组织。人胃癌细胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）由上海社会科学院细胞库提供，常规传代培养。正常胃黏膜上皮细胞系（GES-1）购于上海复祥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用双评分半定量积分法，对CYP2W1的免疫组化结果进行分析。以出现棕黄色或棕色颗粒的细胞作为阳性细胞，CYP2W1的阳性部位在细胞质，高倍（400倍）镜下，随机选取5个视野（每个视野计数细胞数不少于200个）。阳性细胞＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；阳性强度评分：细胞无染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞数得分和阳性强度得分相乘，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），≥9分为（+++），将（++）和（+++）样本判定为阳性表达，（-）和（+）样本判定为阴性表达。

1.2.2 Western blot实验 使用细胞组织快速裂解液裂解组织，提取总蛋白，BCA法检测蛋白质含量，-70℃保存。制备SDS-PAGE，蛋白电泳分离蛋白后转膜，将硝酸纤维素膜放入封闭液中，置于37℃恒温摇床上，低速摇动封闭2 h。将一抗按1∶1 000稀释（参考抗体说明书），4℃摇床低速摇动过夜孵育。洗脱缓冲液洗涤3次，时间分别为15 min、10 min、5 min。洗涤后进行二抗孵育，二抗为羊抗兔，按1∶4 000稀释，置于37℃恒温摇床上，低速摇动孵育45 min。洗脱缓冲液洗涤3次，每次5 min。ECL显色，暗房中曝光，显影定影后胶片保存摄片，扫描后用Bandscan 5.0软件进行灰度分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR 引物设计：CYP2W1上游引物AAGACGGTGGTGCTGACGG，下游引物GCTGGATGAGCTGGAAGATGG，长度106 bp；GAPDH上游引物TCAAGAAGGTGGTGAAGCA，下游引物AAAGGTGGAGGAGTGGGT，长度113 bp。引物由上海生工生物公司合成。提取胃癌细胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）和正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）中总RNA，紫外分光光度计测量总RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。逆转录合成cDNA，qPCR扩增。qPCR反应条件为：94℃、5 min（预变性）一个循环；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共35个循环；72℃、10 min，4℃、2 min。对扩增曲线所获得的Ct值进行分析，利用以前报道的2-△△Ct计算方法，算出CYP2W1mRNA的相对表达量。

1.2.4 平板克隆形成实验 选取对数生长期（BGC-823、GES-1）细胞，常规处理，重悬成单细胞悬液，调整细胞浓度至1× 103/ml，接种，连续培养。出现肉眼可见的克隆时终止细胞培养，PBS液漂洗，固定，加入姬姆萨染液，冲洗，干燥。计数肉眼可见克隆形成的数量，或在低倍镜下计数大于50个细胞的克隆数。克隆形成率=（克隆数/200）×100%。

1.2.5 划痕愈合实验 24孔板背后划线，将BGC-823、GES-1以0.25%胰酶消化，制备培养单层细胞。当细胞铺满全空时，划痕，记录镜下划痕区相对距离。继续培养，分别于0 h、24 h、48 h用PBS洗掉划落的细胞，于倒置显微镜下拍照。倒置显微镜下测量细胞向致伤区迁移的相对距离，计算细胞实际迁移距离。采用Image J软件检测划痕面积，计算划痕愈合率。划痕愈合率=（1-各时间点划痕面积/开始的划痕面积）×100%。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。免疫组化结果相关分析采用χ2检验。统计数据用均数±标准差（±s）表示，使用独立样本t检验，多个样本均数比较应用单因素方差分析（One-way ANOVA），以α=0.05为显著性水准。

2 结果

2.1 CYP2W1蛋白在胃癌组织与正常胃黏膜组织中的表达

CYP2W1蛋白主要表达于癌细胞胞质，胞膜也有不同程度表达，呈浅黄至棕黄色。胃癌组织的CYP2W1阳性表达率为26.69%，显著高于正常胃黏膜组织（0.00%）。胃癌组织与正常胃黏膜组织CYP2W1的阳性表达率有显著性差异（χ2=100.396，P=0.000），见表1。

表1 胃癌与正常胃黏膜组织中CYP2W1蛋白表达比较

2.2 Western blot实验胃癌组织及正常胃黏膜组织CYP2W1蛋白的表达

应用Western blotting实验对随机选取的10例胃癌组织及10例正常胃黏膜组织中的CYP2W1蛋白表达水平进行检测。结果显示，胃癌组织中CYP2W1蛋白表达水平显著高于正常胃黏膜组织（见表2），差异有显著性（P＜0.05）。

表2 胃癌与正常胃黏膜组织中CYP2W1蛋白表达情况

2.3 实时荧光定量PCR检测不同胃癌细胞中CYP2W1 mRNA水平

4株胃癌（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）细胞中CYP2W1 mRNA表达水平明显升高，而正常胃黏膜细胞（GES-1）中CYP2W1 mRNA基本无表达，二者比较差异有显著性（P＜0.05）。此外，BGC-823细胞中CYP2W1 mRNA表达水平显著高于SGC-7901、MKN-28、MGC-803细胞（P＜0.05），而后3种细胞CYP2W1 mRNA表达水平无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 BGC-823及GES-1细胞平板克隆形成实验结果

正常胃黏膜细胞（GES-1）克隆形成的数量（25.18±4.36）明显少于CYP2W1阳性胃癌细胞（BGC-823）克隆形成的数量（57.92±8.17），差异有显著性（P＜0.05）。正常胃黏膜细胞（GES-1）克隆形成率（12.59%）明显低于CYP2W1阳性胃癌细胞（BGC-823）克隆形成率（29.96%），差异有显著性（P＜0.05），表明CYP2W1阳性胃癌细胞的增殖能力明显增强。

2.5 划痕实验检测胃癌细胞的迁徙侵袭能力

应用划痕实验检测胃癌细胞的迁徏侵袭能力，按划痕实验要求逐步操作，拍照记录0 h、24 h、48 h细胞的迁移变化，检测划痕面积，计算划痕愈合率。结果显示：24 h/48 hCYP2W1阳性胃癌细胞（BGC-823）划痕修复率明显高于正常胃黏膜细胞（GES-1），CYP2W1阳性胃癌细胞（BGC-823）划痕愈合面积明显大于正常胃黏膜细胞（GES-1），二者比较差异有显著性（P＜0.05），表明CYP2W1阳性胃癌细胞的迁徙侵袭能力明显增强。

3 讨论

临床研究表明，CYP2W1作为一种特异性的肿瘤因子在近30%的结肠癌中表达，而在正常健康组织中不表达或无意义[1，2]。Stenstedt K等[3]应用免疫组化法检测CYP2W1在235例II期和III期结肠癌中的表达情况。结果显示：CYP2W1在30%的肿瘤中高水平表达，CYP2W1阳性表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关。有学者研究发现，CYP2W1在结直肠癌原发性肿瘤、淋巴结转移及肝转移进展过程中的表达呈升高趋势，1/3的淋巴结转移、近一半的肝转移患者CYP2W1高表达。

本研究结果：326例胃癌组织中，87例CYP2W1表达阳性，阳性表达率为26.69%。显著高于正常胃黏膜组织（0.00%），胃癌组织与正常胃黏膜组织CYP2W1阳性表达率有显著性差异（χ2=100.396，P=0.000）。应用Western blotting实验随机检测10例胃腺癌组织和10例正常胃黏膜组织中CYP2W1蛋白表达情况，进一步证实该结论。采用平板克隆形成实验检测BGC-823细胞增殖能力，结果显示：BGC-823克隆形成数量明显高于GES-1，差异有显著性（P＜0.05）。划痕愈合实验显示：24 h/48 hBGC-823划痕愈合率明显高于GES-1，BGC-823划痕愈合面积明显大于GES-1，差异有显著性（P＜0.05）。

研究表明[4]，在结直肠癌细胞系实验中，表达CYP2W1的细胞系（SW480）显示两种化合物：ICT2705和ICT2706，转换后将CYP2W1共价结合到DNA，导致细胞死亡，而化合物本身对肿瘤细胞无伤害作用。异种移植研究发现，在SCID小鼠体内移植表达CYP2W1的结直肠肿瘤细胞，然后应用ICT2706治疗，已显示出完全抑制肿瘤细胞生长但对动物本身无明显伤害的可喜结果。该研究证明，ICT2705和ICT2706这两种混合物，能够被CYP2W1激活而成为有效的抗肿瘤剂。CYP2W1作为肿瘤靶向治疗的一种新的药物治疗靶标，可能成为肿瘤治疗的又一方法。

[1]Karlgren M，Gomez A，Stark K，et al.Tumor-specific expression of the novel cytochrome P450 enzyme，CYP2W1[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341（2）：451-458.

[2]Gomez A，Karlgren M，Edler D，et al.Expression of CYP2W1 in colon tumors：regulation bygene methylation[J].Pharmacogenomics，2007（8）：1315-1325.

[3]Stenstedt K，Hallstrom M，Johansson I，et al.The expression of CYP2W1：a prognostic marker incolon cancer[J].Anticancer Res，2012（32）：3869-3874.

[4]Travica S，Pors K，Loadman P M，et al.Colon cancer-specific cytochrome P4502W1 converts duocarmycin analogues into potent tumor cytotoxins[J]. Clin Cancer Res，2013（19）：2952-2961.

R735.2

B

1671-1246（2017）03-0151-02