1例阴道定植阿萨希毛孢子菌的基因鉴定及随机扩增多态性DNA分析

杨艳平 时晓玉 张颖 李文 王洁娣 黄文明 樊翌明

(1.广东医学院附属医院皮肤科；2.广东医学院附属医院妇产科，524001 湛江)

·病例报告·

1例阴道定植阿萨希毛孢子菌的基因鉴定及随机扩增多态性DNA分析

杨艳平1时晓玉1张颖2李文1王洁娣1黄文明1樊翌明1

(1.广东医学院附属医院皮肤科；2.广东医学院附属医院妇产科，524001 湛江)

报道1例阿萨希毛孢子菌阴道定植病例。1例25岁健康妇女偶有阴道分泌物稍增多及轻微瘙痒。妇科检查见少量淡黄色均质化分泌物附着于阴道黏膜，阴道分泌物Nugent评分3分。对两次阴道分离菌株进行形态学观察、温度试验、尿素酶试验、药敏试验、3个rDNA基因测序及随机扩增多态性DNA (RAPD)分析。间隔3个月两次阴道分泌物培养均分离出土黄色、表面皱褶的酵母样菌落。该菌在25～37℃生长良好，最佳生长温度为27℃。小培养可见分隔菌丝、假菌丝、关节菌丝、分生孢子、关节孢子和芽生孢子。尿素酶试验阳性。3个rDNA基因测序和RAPD分析显示两次分离菌株为同一种阿萨希毛孢子菌。E-test和Neo-Sensitabs药敏试验发现本菌株对伏立康唑敏感。随访3个月患者仍无明显症状。

阿萨希毛孢子菌；阴道；定植；药敏试验

目前已知毛孢子菌属共有51个种，其中16个种可引起人类疾病[1]。毛孢子菌可定植于人类皮肤、呼吸道、胃肠道和阴道，引起表浅和深部毛孢子菌病、过敏性肺炎[2]。虽然阴道标本中偶可分离出毛孢子菌，但其致病性尚未明确。1985年以来，阴道标本中分离的毛孢子菌共有28株[3-11]，其中仅有皮瘤毛孢子菌 (Trichosporoninkin)可能引起外阴阴道毛孢子菌病[3]。2012年8月～2013年3月，我们共收集了301例可疑的外阴阴道念珠菌病患者阴道分泌物，其中1例无明显症状妇女两次分离到阿萨希毛孢子菌 (T.asahii)。本研究观察了该菌株的形态学特征，并进行温度试验、尿素酶试验、基因鉴定及随机扩增多态性DNA (RAPD)分析。

1 临床资料

患者女，25岁，因婚前体检于2012年11月到我院妇产科门诊就诊。平素身体健康，偶有阴道分泌物稍增多及轻微瘙痒，无长期服用抗生素、激素或免疫抑制剂病史。月经规律，否认阴道冲洗、经期性交、盆浴，但长期穿化纤紧身内裤。该患者及性伴无性病史，采用避孕套避孕7 a。妇科检查见外阴皮肤正常，阴道无明显充血，可见少量淡黄色均质化分泌物附着于阴道黏膜，伴有轻度宫颈肥大和糜烂，子宫及附件未见异常。阴道分泌物检查鳞状上皮细胞 (+)，Nugent评分3分，pH 3.8，氨味试验阴性，未见芽生孢子及假菌丝。阴道分泌物接种在2支含有氯霉素沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)上27℃培养14 d，可见土黄色、表面皱褶的酵母样菌落生长。血常规、肝肾功能检查无异常。

由于临床症状不明显，患者未予治疗。3个月后随访，患者仍无明显症状。复查阴道分泌物镜检结果Nugent评分3分，pH 4.4，氨味试验阴性。革兰染色镜检发现2个革兰阳性长柱形关节孢子黏附于鳞状上皮细胞上，细胞外少量革兰阴性短杆菌 (见图1)。真菌培养结果与前次相同。此后患者失访。

2 真菌学研究

2.1 菌落形态学观察

由于首次分离菌株 (ZJ199)和第2次分离菌株 (ZJ199-2)相同，故真菌学研究仅用ZJ199菌株，阿萨希毛孢子菌 (CBS2479)作为对照菌株。菌株分别接种于大平皿SDA、玉米粉琼脂培养基 (CMA)、酵母菌形态琼脂培养基 (YMA)27℃培养14 d。本菌株在SDA上3 d即有淡黄色菌落生长，直径6 mm，表面不光滑；7 d菌落直径11 mm，奶黄色，表面粗糙，中央隆起、皱褶，周边呈粉末状 (见图2a)；9 d菌落直径15 mm，菌落形态与7 d时相似，背面平坦呈淡黄色。CMA和YMA上菌落形态大致相同，但菌落生长较慢。

2.2 微量培养

本菌株接种于小钢圈SDA、CMA 27℃和37℃培养，显示不同培养基上生长差异较大。CMA 27℃培养5 d，可见真菌丝与假菌丝形成混合菌丝 (见图2b)；37℃培养6 d，可见关节菌丝由长方形、矩形关节孢子连接而成，其上着生侧生孢子 (见图2c)。SDA 37℃培养6 d，可见卵圆形或椭圆形孢子形成假菌丝，偶见假头状分生孢子着生于孢梗上 (见图2d)。

2.3 温度试验

本菌株接种于试管SDA上，分别置于4℃、8℃、25℃、27℃、37℃、42℃、44℃培养2周。结果显示，27℃生长最佳，菌落直径14 mm；25℃、37℃生长良好，菌落直径11 mm；42℃生长一般，菌落直径7 mm；4℃、8℃、44℃均无菌落生长，但将其转至27℃培养1周后仍有菌落生长。

2.4 尿素酶实验

本菌株和对照菌株分别接种于尿素培养基试管中，27℃培养2周。结果显示2个菌株均能使培养基变为红色，呈阳性反应。

2.5 0.1%放线菌酮和20%NaCl耐受试验

本菌株和对照菌株分别接种于含0.1%放线菌酮SDA培养基试管、含20%NaCl MEA培养基试管上，27℃培养2周。结果显示2个菌株均有菌落生长，说明二者均可耐受0.1%放线菌酮、20%NaCl。

2.6 药敏试验

采用NeoSensitabs纸片 (丹麦Rosco公司)和E-test药敏条 (瑞典AB Biomerieux公司)进行体外药敏试验，按说明书进行操作。NeoSensitabs纸片法提示本菌株对伏立康唑敏感，两性霉素B和咪康唑中度敏感，伊曲康唑、氟康唑、卡泊芬净和特比萘芬耐药。E-test药敏结果显示本菌株对伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净的最低抑菌浓度 (MIC)分别为0.25 mg/L、64 mg/L、>32 mg/L、>32 mg/L、>32 mg/L，提示其仅对伏立康唑敏感。

2.7 基因鉴定

用真菌DNA提取试剂盒 (美国Omega公司)提取ZJ199、ZJ199-2、ZJ3063、CBS2479菌株DNA，其中ZJ3063菌株是从1例疑为股癣患者皮损中分离的阿萨希毛孢子菌。真菌引物ITS1/ITS4、NL1/NL4、26SF/5SR分别用于扩增rDNA内转录间隔区 (ITS)、D1/D2区、基因间隔区1 (IGS1)[12-13]。扩增产物送广州华大基因科技有限公司测序，测序结果与GenBank上有关序列进行BLAST分析。本实验所测的CBS2479 ITS、IGS1、D1/D2区序列，与GenBank上该菌株相应序列 (登录号分别为FJ943429、FJ754250、EU559350)完全一致。由于ZJ199、ZJ199-2菌株具有相同序列，故仅将ZJ199菌株ITS (485 bp)、IGS1 (582 bp)、D1/D2区 (571 bp)序列提交至GenBank，登录号分别为KF501144、KF501145、KF501146。序列比对结果：本菌株ITS、IGS1、D1/D2区序列与GenBank中部分阿萨希毛孢子菌同源性达100% (ITS：FJ943429、KC127676；IGS1：JX111988、EU934811；D1/D2区：FJ463632、EU559350)。然而，本菌株与CBS2479 IGS1序列覆盖率和同源性分别为100%、97%，存在17个碱基差异。

2.8 RAPD分析

25个随机引物 (OPF-01～OPF-20、ATGS、OPAO-15、OPI-03、OPI-14、OPK-20)由上海生工生物工程股份有限公司合成，预实验结果发现OPAO-15 (5’-GAA GGC TCC C-3’)和OPI-14 (5’-TGA CGG CGG T-3’)可获得清晰、稳定、重复性好的特异性条带。RAPD反应体积15 μL，其中模板DNA 2 μL，5 pmol/L引物1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，25 mmol/L MgCl21 μL，5 U/μL Taq聚合酶 (Takara公司)0.2 μL，10×缓冲液1.5 μL，双蒸水8.3 μL。反应条件：预变性94℃ 2 min；变性94℃ 1 min，退火38℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共循环36次；最后延伸72℃ 10 min。上述反应产物中加入6×加样缓冲液1 μL，取混合液8 μL于1.2%琼脂糖凝胶上电泳100 min，4S Green核酸染料 (上海生工生物工程股份有限公司)染色，紫外线凝胶成像系统观察结果。

OPAO-15和OPI-14引物的RAPD结果显示菌株ZJ199与ZJ199-2的电泳条带一致，但其与对照菌株 (CBS2479、ZJ3063)电泳条带有明显不同 (见图3)，提示两次分离的阿萨希毛孢子菌可能为同一菌株。

图1 阴道分泌物革兰染色镜检显示2个革兰阳性长柱形关节孢子黏附于鳞状上皮细胞，细胞外少量革兰阴性短杆菌 (×1 000) 图2 阿萨希毛孢子菌培养：a.27℃ SDA培养7 d，奶黄色菌落直径11 mm，表面粗糙，中央隆起、皱褶，周边呈粉末状；b.混合菌丝 (CMA，27℃，5 d，×400)；c.关节菌丝及其侧生孢子 (CMA，37℃，6 d，×400)；d.假菌丝及孢梗上着生假头状分生孢子 (SDA，37℃，6 d，×1 000) 图3 阿萨希毛孢子菌RAPD分析 (1.Marker；2.CBS 2479；3.ZJ3063；4.ZJ199；5.ZJ199-2)：OPAO-15、OPI-14显示2个阴道分离菌株 (ZJ199、ZJ199-2)电泳条带一致，但与对照菌株 (CBS2479、ZJ3063)电泳条带有明显不同

Fig.1 Gram-stained smear showed two Gram-positive cylindrical arthroconidia on a squamous cell and some small gram-negative rods (Gram-stain,×1 000) Fig.2 Culture results ofTrichosporonasahii:a.A creamy,11 mm in diameter,heaped-up and wrinkled colony with a furrowed farinose margin on SDA at 27℃ for 7 days;b.Mixed hyphae on CMA at 27℃ for 5 days (×400);c.Arthrofilaments and lateral conidia on CMA at 37℃ for 6 days (×400);d.A pseudohypha and conidiophore bearing false-headed conidia on SDA at 37℃ for 6 days (×1 000) Fig.3 RAPD analysis ofTrichosporonasahii(1.Marker;2.CBS 2479;3.ZJ3063;4.ZJ199;5.ZJ199-2):The electrophoretic bands of two vaginal siolates (ZJ199 and ZJ199-2) for OPAO-15 and OPI-14 were identical,but different from the control strains (CBS 2479 and ZJ3063)

3 讨 论

由于白吉利毛孢子菌 (T.beigelii)名称已在1990年代废除，故在1980年代报道的6株阴道毛孢子菌难以确定种类[4-5]。2003年以来，阴道分泌物中共分离出毛孢子菌22株，包括皮瘤毛孢子菌14株、阿萨希毛孢子菌1株、星形毛孢子菌 (T.asteroides)1株、日本毛孢子菌 (T.japonicum)1株及未定种5株[3,6-11]。Makela等[3]在13例患者阴道分泌物中分离到皮瘤毛孢子菌，其中9例合并其他感染、3例无症状，仅1例有复发性外阴阴道炎症状并排除其他感染。吕雪莲等[6]报道了国内首例皮瘤毛孢子菌阴道定植病例。

阿萨希毛孢子菌是深部毛孢子菌病的最常见病原菌[2]，但其是否引起阴道炎尚不清楚。Abliz等[12]在我国1例阿萨希毛孢子菌引起的系统性感染患者阴道内分离出该菌，这是血源性播散的结果。Arechavala等[7]在94例阿根廷急性外阴阴道念珠菌病患者中，分离出1株阿萨希毛孢子菌[7]，但其可能是定植而非感染。根据异常阴道菌群分级[13]，本例患者具有正常阴道pH (3.8～4.4)和菌群 (Nugent评分3分)，未见白细胞；虽然间隔3个月阴道分泌物中两次分离出阿萨希毛孢子菌，但仅在第2次涂片发现少量关节孢子附着于鳞状上皮细胞，也无菌丝出现；在未予治疗的情况下，随访3个月仍然缺乏阴道炎症状。这些结果表明本例患者阴道内阿萨希毛孢子菌处于定植状态。

传统真菌鉴定方法不能有效区别毛孢子菌种，至少需要同时应用2个rDNA基因才能准确鉴定至种的水平[2]。本菌株的ITS和D1/D2区序列与CBS2479完全一致，但两者的IGS1序列有17个碱基差异，说明IGS1适用于鉴别毛孢子菌[14]。随机引物OPAO-15已用于确定阿萨希毛孢子菌种内差异[12,15]。本研究筛选了25个随机引物，发现OPAO-15和OPI-14可有效鉴别阿萨希毛孢子菌。OPAO-15和OPI-14的RAPD结果显示菌株ZJ199与ZJ199-2的电泳条带一致，但与对照菌株有明显差异。根据3个rDNA基因测序和RAPD分析，提示患者的两次分离菌株为同一菌株。

药敏试验显示毛孢子菌对三唑类抗真菌药物的敏感性高于两性霉素B和棘白菌素类，其中伏立康唑最敏感[2]。阿萨希毛孢子菌对唑类抗真菌药物的敏感性优于非阿萨希毛孢子菌，特别是伏立康唑和泊沙康唑[8]。本文的E-test和Neo-Sensitabs纸片法发现本菌株对伏立康唑敏感，提示伏立康唑可能是外阴阴道毛孢子菌病最有效药物。此外，与M27-A2微量肉汤稀释法相比，NeoSensitabs纸片法不能区别两性霉素B耐药酵母菌[16]。本菌株用E-test显示对两性霉素B耐药，而NeoSensitabs纸片法为中度敏感，提示纸片法可能不适用于判断阿萨希毛孢子菌对两性霉素B敏感性。

综上所述，本文首次报道无症状妇女阴道中存在阿萨希毛孢子菌持久性定植，但其临床意义有待进一步证实。

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Vaginal colonization ofTrichosporonasahiiin an asymptomatic woman using gene identification and random amplified polymorphic DNA

YANG Yan-ping1,SHI Xiao-yu1,ZHANG Ying2,LI Wen1,WANG Jie-di1,HUANG Wen-ming1,FAN Yi-ming1

(1.DepartmentofDermatology;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics;AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

To report a case of vaginal colonization ofTrichosporonasahii.A 25-year-old healthy woman occasionally developed mild itching and vaginal discharge.Gynecological examination showed a small amount of yellowish homogenous vaginal discharge.Nugent score of vaginal discharge was 3.Two strains isolated from vaginal discharge were analyzed by phenotypic observation,temperature test,urea enzyme test,antifungal susceptibility test,3 rDNA gene sequencing and random amplified polymorphic DNA (RAPD).The earthy yellow and wrinkled yeast-like colonies were twice isolated from the vaginal discharge at 3-month intervals.The isolate grew well at 25-37℃,with the optimal growth temperature of 27℃.Slide culture revealed septate hyphae,pseudohyphae,arthrofilaments,conidia,arthroconidia,and blastospores.The strain was urease positive.Both isolates belonged to the same strain ofT.asahiiusing 3 rDNA gene sequencing and RAPD analysis.E-test and Neo-Sensitabs results revealed that the isolate was sensitive to voriconazole.The woman remained asymptomatic during 3-month follow-up.

Trichosporonasahii;vagina;colonization;antifungal susceptibility

34-37]

国家自然科学基金 (81171512)

杨艳平，女 (汉族)，硕士，主治医师.E-mail:41505019@qq.com

樊翌明,E-mail:ymfan1963@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2017)12-0034-04

2016-01-15 [本文编辑] 王 飞