含PxIxIT模序烟曲霉KpsF基因作用初探

李佳娟 李雯 马彦

(1.山西医科大学，太原 030001；2.山西医科大学第二医院皮肤科，太原 030001)

·论著·

含PxIxIT模序烟曲霉KpsF基因作用初探

李佳娟1李雯1马彦2

(1.山西医科大学，太原 030001；2.山西医科大学第二医院皮肤科，太原 030001)

目的 构建烟曲霉KpsF 基因缺陷株，初步了解KpsF基因在烟曲霉生长及与钙调磷酸酶相互作用关系。方法 PCR扩增烟曲霉KpsF基因及其上、下游各约1.0 kb的DNA片段，以pyrG为筛选标记，原生质体法构建KpsF基因缺陷株ΔKpsF；观察ΔKpsF一般生长状况；实时荧光定量PCR方法检测Ku80 (对照组)和ΔKpsF (实验组)在含有不同浓度CaCl2的液体GMM培养基中钙调磷酸酶催化亚基 (CnaA)相对表达水平。结果 烟曲霉ΔKpsF和Ku80径向生长差异无统计学意义 (P>0.05)；表型未见明显差别；ΔKpsF在10 mmol/L CaCl2GMM液体培养基的CnaA相对表达量显著高于对照组Ku80 (P<0.01)，而100 mmol/L CaCl2的CnaA相对表达量却没有明显变化 (P>0.05)。结论 KpsF基因缺陷对烟曲霉的径向和表型生长没有明显影响，对CnaA表达量的影响与Ca2+浓度有关。在低浓度Ca2+条件下，KpsF可能参与对钙调磷酸酶的负反馈调节作用，而在高浓度的Ca2+条件下，这种负反馈调节作用受到抑制。

烟曲霉；钙调磷酸酶；KpsF基因；PxIxIT模序

近年来侵袭性曲霉病 (invasive aspergillosis,IA)感染发生率呈上升趋势,其最常见的感染者为实体器官、造血干细胞移植及恶性血液病患者[1]。IA最主要病原真菌是烟曲霉，目前其对人体的致病机制仍在研究中[2]。钙调磷酸酶 (Calcineurin，CaN)是Ca2+/钙调蛋白 (CaM)依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，由催化亚基CnaA和调节亚基CnaB组成，其在所有真核生物中均存在，且在进化上相对保守。Aramburu等[3]总结表明CnaA由5部分组成：氨基末端，一个催化区域和三个调节域 (CnaB结合区域，CaM结合区域和自抑制区域 (auto-inhibitory，AI))。当不存在Ca2+时，AI区域会阻断CnaA活性位点，此时CaN 是没有活性的；当存在有Ca2+时，CaN与Ca2+/CaM结合形成复合物，引起构象的改变，使AI发生移位暴露出活性位点，从而激活CaN[3]。研究表明，CaN通过CnaA同底物的PxIxIT模序相互作用，其下游底物Crz1、Slm1、Slm2、Hph1等基因中均发现有类似模序[4-6]，该模序内氨基酸的精细变动同各底物对应的生理信号传导相对应[7]。烟曲霉基因组中是否存在含有类似PxIxIT模序而我们尚未发现的基因？该基因同CaN如何作用？也许能帮助我们进一步了解烟曲霉钙调磷酸酶信号传导路径，以及为IA的治疗提供更多的科学思路。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒来源

Ku80为烟曲霉对照菌株 (wt)，烟曲霉转化用宿主菌为尿嘧啶营养缺陷株Ku80 pyrG-，该菌株在没有尿嘧啶和尿苷的培养基上不能生长。筛选标记pyrG来源于质粒pJW24 (由杜克大学William J.Steinbach教授赠送)。

1.2 主要试剂

溶壁酶购自Sigma公司，GMM培养基，等渗培养基，Trapping缓冲液，聚乙二醇氯化钙溶液，STC溶液等均由本实验室配置；RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT Master Mix，SYBR○RPremix Ex TaqTMII均购自宝生物 (大连)工程有限公司。

1.3 生物信息学分析

在烟曲霉基因组 (www.aspergillusgenome.org)查找发现KpsF基因包含有PxIxIT模序，并对常见的模式真菌进行同源序列比对分析。

1.4 构建KpsF基因敲除株

KpsF基因克隆及敲除载体的构建 烟曲霉Ku80 pyrG-在GMM+YG+UU液体培养基中过夜培养，过滤收集菌丝；提取基因组DNA。设计引物分别扩增KpsF基因5′和3′侧翼序列各约1.0 kb的DNA序列：首先将3′侧翼序列扩增后，使用限制性内切酶EcoR I和SalI将其克隆连接进入质粒pJW24；其次扩增5′侧翼序列，使用限制性内切酶NotI和BamH I将5′侧翼序列克隆连接进入上一步产生的质粒中构建成功敲除质粒；最后使用限制性内切酶NotI和SalI将敲除质粒进行酶切，然后使用烟曲霉原生质体转化法进行转化。试验中用到的引物见表1。

表1 构建烟曲霉KpsF基因缺陷株使用到的引物

烟曲霉原生质体法构建KpsF基因缺陷株 具体实验方法见文献[8]。

1.5 Southern blot验证KpsF基因缺陷株

设计上下游引物命名为KpsF-probe-F，KpsF-probe-R (见表1)。对照组 (wt)和四个转化子 (1、2、3、4)的基因组DNA均用限制性内切核酸酶KpnI进行消化酶切，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，余步骤按照试剂盒说明进行。

1.6 ΔKpsF和Ku80生长速度和表型观察比较

在固体GMM培养基上，接种1×106cells/mL的ΔKpsF和Ku80菌悬液10 μL，37℃恒温下培养5 d，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h观察记录菌落直径；表型观察采用小培养方法，具体步骤详见参考文献[9]，实验重复3次。

1.7 RT-PCR比较在不同浓度Ca2+液体培养基条件下ΔKpsF和Ku80两菌株的CnaA相对表达量

从烟曲霉基因库中查询CnaA基因，设计特异性引物，以β-tubulin作为内参 (见表2)。分别加ΔKpsF和Ku80菌悬液500 μL于5 mL配好的含有不同浓度CaCl2的液体培养基中，200 r/min，37℃恒温摇床培养18 h，过滤收集菌丝，-80℃冰箱冻存备用。使用Trizol法的提取总RNA，逆转录合成cDNA (20 μL体系所需mRNA不超过为1 000 ng)。RT-PCR扩增体系：cDNA 1 μL，正、反向引物各1μL，SYBR○RPremix Ex TaqTMII 12.5 μL，灭菌蒸馏水补充至25 μL。扩增条件如下：95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s变性，56℃ 30 s退火延伸，重复40个循环。CnaA表达量的计算采用ΔΔCt方法，ΔΔCt=(目的基因Ct值-内参基因Ct值)实验组-(目的基因Ct值-内参基因Ct值)对照组。

表2 RT-PCR引物列表

1.8 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。两菌株径向生长采用重复测量方差分析，不同浓度CaCl2处理采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)，取P<0.05为差别有统计学意义，P<0.01为差别有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 烟曲霉KpsF基因生物信息学分析

通过生物信息学方法，从烟曲霉基因组找出KpsF基因，编号为Afu6g08860,序列分析发现KpsF基因含有1 404个碱基，编码443个氨基酸，蛋白序列发现KpsF基因具有类似PxIxIT模序-PVIAIT (见图1中黄色标记部分)。烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)、粗糙脉胞菌霉 (Neurosporacrassa)、新生隐球菌 (Cryptococcusneoformans)和白色念珠菌 (Candidaalbicans)四种常见模式真菌的KpsF基因的同源序列比对结果见图1。

2.2 烟曲霉KpsF基因敲除质粒构建

详见图2。由图可见烟曲霉KpsF基因使用筛选标记pyrG替代。

2.3 Southern blot验证结果

wt为对照株Ku80，M为DNA marker，在约809 bp处，泳道1、4处有一清晰条带 (见图3)，而对照组Ku80未见明显条带，说明1、4为成功转化的烟曲霉缺陷株ΔKpsF。

2.4 ΔKpsF和Ku80生长速度和表型观察结果

详见图4和图5。经重复测量方差分析显示两菌株径向生长P>0.05，结果未见明显差异，说明KpsF基因缺陷对于烟曲霉径向生长没有明显影响，图a和b两菌株径向生长结果 (37℃，培养72 h)；乳酸酚棉兰染色对ΔKpsF和Ku80进行表型观察：图c和d中可见两菌株菌丝细长，分枝多呈45°，排列整齐 (棉兰，×200)，图e和f中的红色箭头为菌丝隔膜，清晰明显 (棉兰，×400)，图g和h可见分生孢子头呈短柱状，孢子梗壁光滑 (棉兰，×400)；两菌株表型观察结果未见明显差异。

2.5 RT-PCR方法检测CnaA基因相对表达结果

对照组GMM液体培养基的ΔKpsF的CnaA表达量是Ku80的2.81倍，ΔKpsF的CnaA表达量略高于Ku80；在10 mmol/L Ca2+浓度下，ΔKpsF的CnaA基因表达量是Ku80的29.94倍 (见图6)；而在100 mmol/L Ca2+浓度下，ΔKpsF和Ku80的CnaA相对表达量没有差异；单因素方差分析表明ΔKpsF在不同Ca2+浓度条件下相对于Ku80的CnaA表达量差异有统计学意义 (P<0.05)，并且在低浓度Ca2+条件下差异显著 (P<0.01)。

3 讨 论

钙调磷酸酶 (CaN)包括CnaA和CnaB两个亚基，能识别多种底物，并且影响真核细胞的发育和生理功能，是临床常用的免疫抑制剂环孢素A (cyclosporineA，CsA)和他克莫司 (tacrolimus,FK506)的靶蛋白，然而由于FK506和CsA免疫抑制作用，使其在治疗侵袭性曲霉菌感染患者中的应用受到限制。因此，研究烟曲霉钙调磷酸酶相关的底物或者靶蛋白，识别内源性钙调磷酸酶抑制剂是一个重要的策略[10]。Steinbach等[8]通过构建△CnaA，证实CaN在烟曲霉菌丝生长和毒力方面的关键作用。Juvvadi等[10]通过构建△CnaA和CnaA+GFP等菌株，发现CnaA定位于烟曲霉菌丝的尖端和分隔处，从而证实了CaN在隔膜形成中的作用。PxIxIT模序首先在NFAT中被发现且其高度保守[11]，CaN通过CnaA同底物的PxIxIT模序相互作用，发挥其生理作用。Pinchai等[12]研究证明CbpA是钙调磷酸酶内源性的抑制剂成员之一，并且参与菌丝的生长和钙离子体内平衡。Juvvadi等[13]发现CbpA基因中存在PxIxIT类似模序 (PVDPGT)，且该模序在与钙调磷酸酶相互作用中起到重要作用。通过生物信息学方法发现烟曲霉KpsF基因蛋白序列中有类似PxIxIT模序 (PVIAIT)存在，所以推测KpsF基因可能为烟曲霉钙调磷酸酶新的底物或者靶蛋白，其如何同钙调磷酸酶相互作用，对烟曲霉的致病性有何影响有待进一步研究。

图1 常见真菌中KpsF同源序列比对结果 图2 构建KpsF基因敲除载体示意图,烟曲霉KpsF基因用筛选标记pyrG替代 图3 Southern blot验证烟曲霉KpsF基因缺陷株，wt为对照株Ku80，M为DNA marker (bp) 图4 ΔKpsF和Ku80两种菌株在GMM培养基上不同时间点的径向生长结果 图5 ΔKpsF和Ku80两菌株径向生长和乳酸酚棉兰染色观察表型生长：a,b.两菌株径向生长结果 (37℃，培养72 h)；c,d.两菌株菌丝细长，分枝多呈45°，排列整齐 (棉兰，×200)；e,f.红色箭头为菌丝隔膜，清晰明显 (棉兰，×400)；g,h.分生孢子头呈短柱状，孢子梗壁光滑 (棉兰，×400) 图6 在不同浓度CaCl2处理条件下的CnaA基因相对表达量 (*.P<0.05，**.P<0.01，1 mM=1 mmol/L)

Fig.1 The homologous sequence alignment results of KpsF gene in common fungi Fig.2 Sketch map of KpsF gene deletion,KpsF gene replaced by selection marker pyrG Fig.3 The verification of ΔKpsF strains by Southern blot (wt.The control strains Ku80,M.DNA marker) Fig.4 The radial growth results of ΔKpsF and Ku80 on the GMM medium at 37℃ for 24 h,48 h,72 h,96 h,120 h Fig.5 Radial growth and phenotypic growth of ΔKpsF and Ku80:a,b.Radial growth of two strains (cultured at 37℃,72 h)；c,d.Microculture:Hyphae branch with 45°(Lactophenol Cotton Blue,×200)；e,f.Septum was clear (marked with red arrow,Lactophenol Cotton Blue,×400)；g,h.Conidium and Conidiophore of two strains (Lactophenol Cotton Blue,×400)Fig.6The relative expression of CnaA of two strains under the treatment of different concentration of CaCl2,1 mM=1 mmol/L

本研究通过在不同时间点对ΔKpsF与Ku80菌落直径进行重复测量，并经统计学分析发现ΔKpsF与Ku80径向生长没有明显差异，说明KpsF基因缺陷对烟曲霉径向生长没有影响；高倍显微镜下观察小培养结果：ΔKpsF和Ku80菌丝细长，分枝多呈45°，排列整齐 (棉兰，×200)；菌丝分隔清晰，分生孢子头呈短柱状，孢子梗壁光滑 (棉兰，×400)，表明两菌株形态表现无明显差别。而Pinchai等[12]研究发现，ΔCbpA与野生株相比径向生长下降约30%。Juvvadi等[10]在显微镜下观察发现，相对于野生株，ΔCnaA菌丝高度分枝。由此可见，烟曲霉CbpA与KpsF基因虽然都含有类似PxIxIT模序，但是两基因功能是有差别的，也就是说KpsF基因缺陷对烟曲霉的径向和表型生长影响不明显。

既往研究表明CbpA和CnaA对Ca2+的调节有重要影响，Pinchai等[12]研究发现，在200 mmol/L CaCl2存在的条件下，ΔCbpA菌株的CnaA基因的表达量是对照组Ku80的3.2倍，表明CbpA可能参与的钙调磷酸酶信号通路的负反馈调节,与先前研究结果不同，本研究发现在对照GMM液体培养基上，ΔKpsF的CnaA表达量是Ku80的2.81倍 (P<0.01)，在10 mmol/L Ca2+条件下，ΔKpsF表达量是Ku80的29.76倍 (P<0.01)。在100 mmol/L Ca2+条件下，ΔKpsF与Ku80的CnaA表达量无差别 (P>0.05)。说明在低浓度Ca2+条件下，KpsF基因可能参与钙调磷酸酶的负反馈调节，并且在10 mmol/L Ca2+条件下负反馈调节作用明显，但是在高浓度Ca2+条件下该负反馈调节作用却受到抑制，说明CbpA与KpsF与钙调磷酸酶相互作用机制有明显不同。

KpsF作为新发现的基因，其具体功能仍在初步探索中，本研究发现烟曲霉KpsF基因对CnaA表达水平的影响与Ca2+浓度高低有关。条件允许的情况下我们可以通过蛋白印记的方法检测钙调磷酸酶的表达情况，或者通过构建ΔKpsFΔCnaA菌株进一步探究KpsF与CaN的关系，对KpsF基因做更全面的研究。

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The study of KpsF gene which contains PxIxIT motif inAspergillusfumigatus

LI Jia-juan1，LI Wen1,MA Yan2

(1.ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China；2.DepartmentofDermatology，TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Objective To construct the KpsF gene defect strains ΔKpsF and to explore the interaction between KpsF gene and calcineurin.Methods Amplificated the upstream and downstream of KpsF about 1.0 kb DNA fragments，the pyrG of plasmid pJW 24 was used as a biomarker when constructting the knockout plasmid.Recombinant plasmid was transformed intoA.fumigatusKu80pyrGand got ΔKpsF.To observer the radial and phenotypic growth of Ku80 and ΔKpsF,Real-time PCR was used to determine the relative expression of calcineurin catalytic subunit (CnaA) of Ku80 (control group)and ΔKpsF (experimental group) in GMM liquid medium containing different concentration of CaCl2.Results Compared with Ku80,the radial growth of ΔKpsF had no obvious change (P>0.05)，and the phenotypic growth had no obvious difference.In GMM Liquid medium containing 10 mmol/L CaCl2,the relative expression of CnaA of ΔKpsF strain was significantly higher than Ku80 (P<0.01).However,the relative expression of CnaA did not obviously changed (P>0.05) in GMM Liquid medium containing 100 mmol/L CaCl2.Conclusions The KpsF had no effect in radial and phenotypic growth ofA.fumigatus.Under the condition of different concentrations of Ca2+,the relative expression levels of CnaA gene were different between ΔKpsF and Ku80,suggesting that the KpsF might be involved in the feedback regulation of calcineurin under the condition of low concentration of CaCl2.

Aspergillusfumigatus；Calcineurin；KpsF gene；PxIxIT motif

8-12]

国家青年科学基金 (81101233)，山西省青年科技研究基金 (2010021036-2)，山西省卫生计生委科研课题 (2015043)，山西省回国留学人员科研资助项目 (2016-052)

李佳娟，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:642322732@qq.com

马彦,E-mail:mayan197522@163.com

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0008-05

2016-10-20 [本文编辑] 卫凤莲